[发明专利]一种转基因水稻Bt蛋白cry2a的原核表达及纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种转基因水稻Bt蛋白cry2a的原核表达及纯化方法。

背景技术

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis Berliner，简称Bt)是一种分布极其广泛的、在其生活史中能形成芽胞和产生多种蛋白晶体的革兰氏阳性细菌。Bt是目前微生物农药中研究最为深刻、应用最为广泛的微生物杀虫剂，它至少对无脊椎动物中线性动物门、原生动物门、扁形动物门等4个门以及节肢动物中九个目的有害生物有活性，对人、畜无毒，害虫不易产生抗性、成本低、易于工业化生产，半个世纪以来已广泛应用于全球的多种农业和林业害虫的生物防治。

Bt能产生对多种昆虫或无脊椎动物有害的毒素，这些毒素有的是蛋白质，有的是小分子物质，有的在细菌营养生长期产生，有的在芽孢形成期产生，有的分泌到细菌外，有的贮存在细胞内。目前的Bt毒素最常见的是杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins，ICPs)，也称δ-内毒素(delta-endotoxin)，于芽胞形成期在菌体的一端或两端形成，Bt的杀虫大多或完全依赖于ICPs(依昆虫而定)，它的形状、结构和大小均与其毒力有着密切关系。其中cry2a就是ICPs基因的一种，产生的cry2a蛋白能用于杀虫实验及转基因植物的抗虫防护。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种转基因水稻Bt蛋白cry2a的原核表达及纯化方法，选取抗虫的Bt--cry2a为对象，利用原核表达系统表达cry2a蛋白，并用亲合层析纯化表达产物，以获得较高纯度的表达蛋白cry2a。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案来实现：

一种转基因水稻Bt蛋白cry2a的原核表达方法，包括以下步骤：

1)根据华中农业大学测序好的cry2a的基因，以及所要连接的载体PMD18-T的多克隆位点设计并合成的正、反向引物，进行PCR扩增、回收，并对该PCR回收物进行DNA连接反应；

2)大肠杆菌感受态细胞的制备和转化；

3)表达质粒的重组构建、重组菌的诱导表达。

所述正、反向引物的序列如SEQ ID No 1和SEQ ID No 2所示，具体如下：

正向引物：5’-CGGGATCC(BamHI)ATGAACAACGTGCTGAACAGCGGCAG-3’；

反向引物：5’-CGGAATTC(EcoRI)TTAGTAGAGTGGCGGCAGGTTGGTG-3’。

所述大肠杆菌感受态细胞为E.coli DH5α和E.coil Transetta(DE3)。

进一步的，通过Ni-NTA亲和层析进行表达蛋白纯化。

所述转基因水稻Bt蛋白cry2a在胶体金免疫层析试纸条中的应用。

本发明是通过制备cry2a蛋白的抗体在胶体金免疫技术中的应用来达到检测BT基因的目的。胶体金免疫技术，是90年代新兴的一种免疫学方法，现在生物医学各领域得到了日益广泛的应用。它实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程，显色程度与抗原含量成正比。

本发明通过制备转基因水稻Bt蛋白cry2a进而获得抗体，并制作成胶体金免疫层析试纸条，以便在转基因植物检测中快速、准确的检测出Bt基因。

本发明所研制的胶体金免疫层析试纸条是将金标苏云金芽孢杆菌cry2a单克隆抗体喷涂在玻璃纤维膜上。由于毛细管作用，样品将沿着硝酸纤维素膜移动，当有苏云金芽孢杆菌cry2a存在时继而被固定的抗体着色，在样品观察区(S区)可形成一条色带，以此来检测Bt基因的存在。同时内置质控色带(C区)是为了确认该实验是否成立。胶体金免疫技术具有便捷、快速、灵敏、安全、低成本等特点，由于不需要酶促反应的底物，单份测定，除试剂外无需任何特殊的仪器设备，且试剂稳定，近年来发展迅速。该法检测速度快，一般一两分钟可出结果，灵敏度高，可达50IU/L。

本发明所述一种转基因水稻Bt蛋白cry2a的原核表达及纯化方法，操作简单、成本低，并制备得到纯度在90％以上的表达蛋白cry2a。进一步，利用本发明制备的高纯度转基因水稻Bt蛋白cry2a可获得抗体，并可制作成胶体金免疫层析试纸条，为在转基因植物检测中快速、准确的检测出Bt基因提供了可能。

附图说明

图1为cry2a的原核表达及纯化路线图。

图2为cry2a基因PCR扩增结果，其中泳道3为质粒PCR扩增；泳道4为空白对照。