[发明专利]前体流加发酵生产L-色氨酸的方法

权利要求书

1.前体流加发酵生产L-色氨酸的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)菌种筛选：取大肠杆菌基因工程菌(E.coli K12W3110)ATCC 27325菌液，用已灭过菌的pH为6～8的磷酸盐缓冲液稀释10³～10⁶倍后涂布于LB平板，于35～37℃培养18～30h；从LB平板中挑选单菌落涂布于新的LB平板，于35～37℃再培养18～30h，将得到的单菌落用pH为6～8的磷酸盐缓冲液振荡稀释，然后涂布于新的LB平板，于35～37℃培养18～30h后得到菌层，用LB培养基洗下菌层，然后将菌液加入到无菌保种管，按1∶1比例加入40％的无菌甘油后于-20℃保存备用；

2)一级摇瓶种子：将步骤1)得到的菌液以0.1％～1％的接种量接种于装有一级种子培养基的摇瓶中，于35～37℃，以150～250rpm培养10～20h；

3)二级发酵罐种子：将步骤2)得到的一级摇瓶种子以1％～10％的接种量接种于装有二级种子培养基的种子罐中，控制风量6～12L/min，转速300～500rpm，温度35～37℃，罐压0.05～0.08MPa，pH值通过氨水控制在6.5～7.0，培养10～20h；

4)发酵培养：将步骤3)得到的二级发酵罐种子以1％～10％的接种量接种于装有发酵培养基的发酵罐中发酵，控制风量15～30L/min，转速300～700rpm，温度35～37℃，罐压0.05～0.08MPa，pH值通过氨水控制在6.5～7.0；流加葡萄糖浓度为500～600g/L，采用低糖补料的方法，维持溶氧在10％～30％，同时在菌体进入对数期时开始流加浓度为200～300g/L的邻氨基苯甲酸，初始流加速度为0.1～0.3g/L/h，之后逐渐增大，至发酵结束时流加速度为0.6～0.8g/L/h，发酵周期30～40h，产物L-色氨酸产量40～50g/L，邻氨基苯甲酸转化量6～8g/L，糖酸转化率20％～22％。

2.如权利要求1所述的前体流加发酵生产L-色氨酸的方法，其特征在于上述步骤1)中，所述LB培养基的组成为酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂15～20g/L，盐酸四环素10～100mg/L，灭菌前pH值7.2～7.5。

3.如权利要求1所述的前体流加发酵生产L-色氨酸的方法，其特征在于上述步骤2)中，所述一级种子培养基的组成为磷酸氢二钾15～30g/L，酵母粉10～20g/L，磷酸二氢钾6～18g/L，硫酸铵2～10g/L，七水硫酸镁1～5g/L，葡萄糖20～40g/L，盐酸四环素10～100mg/L，灭菌前pH值7.2～7.5。

4.如权利要求1所述的前体流加发酵生产L-色氨酸的方法，其特征在于上述步骤3)中，所述发酵培养基的组成为磷酸氢二钾2～8g/L，酵母粉1～5g/L，七水硫酸镁1～5g/L，硫酸铵1～5g/L，柠檬酸三钠二水物1～5g/L，葡萄糖20～50g/L。

5.如权利要求1所述的前体流加发酵生产L-色氨酸的方法，其特征在于上述步骤4)中，所述发酵培养基的组成为磷酸氢二钾5～15g/L，酵母粉1～5g/L，七水硫酸镁1～5g/L，硫酸铵1～5g/L，柠檬酸1～5g/L，硫酸亚铁50～200mg/L，葡萄糖10～30g/L。