[发明专利]前体流加发酵生产L-色氨酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及L-色氨酸，尤其是涉及一种前体流加发酵生产L-色氨酸的方法。

背景技术

L-色氨酸(L-Trp)是一种含有吲哚基的中性芳香族氨基酸，是人和动物生命活动中不可缺少的必需氨基酸之一。由于L-色氨酸及其代谢产物对机体的广泛作用，其在医药领域的用途一度成为医学界的研究热门，到目前为止，L-色氨酸作为治疗癞皮病、精神分裂症、营养药剂、人工膳食和必需氨基酸片的用途已经得到了广泛的承认(李剑欣，张绪梅，徐琪寿.色氨酸的生理生化作用及其应用[J]氨基酸和生物资源，2005，27(3)：58-62)。L-色氨酸在食品工业的应用价值主要在于它被广泛地用作食品添加剂、调味剂和抗氧化防腐剂。近年来，由于在配合饲料中大量使用合成的蛋氨酸和赖氨酸，使得L-色氨酸成为饲料中主要的限制性氨基酸，是继蛋氨酸和赖氨酸之后的第三大饲料添加剂(张炳荣.氨基酸工业大全[M].北京：轻工业出版社，1991)。

早期的L-色氨酸的生产方法主要依靠化学合成法和蛋白质水解法，但是由于这些方法存在着材料来源有限、周期长、工艺复杂、产品成分复杂等缺点，因而在上世纪90年代逐渐被淘汰，随着对微生物法生产L-色氨酸研究的不断深入，微生物法已经走向实用并且处于主导地位。微生物法大体上又可以分为酶法、微生物转化法和微生物发酵法(张克旭.氨基酸发酵工艺学[M].北京：中国轻工业出版社.1992：712-722)。酶法和微生物转化法的高成本已困扰研究工作者多年，进展不大，难以实现大规模低成本生产L-色氨酸。而微生物发酵法具有产酸高、成本低、质量好等优势，将是未来大规模生产L-色氨酸的首选技术。

目前，微生物发酵产L-色氨酸主要使用到的菌种为谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌。在谷氨酸棒杆菌方面，Katsumata等(Katsumata R，Ikeda M.Hyperproductiion of tryptophan inCorynebacterium glutamicum by pathway engineering.Nature Bioechnology，1993，11：921-925)将带有7-磷酸-2-酮-3-脱氧庚糖酸(DAHP)合成酶和色氨酸合成酶的质粒引入产色氨酸的谷氨酸棒杆菌KY10894，发酵80h使得L-色氨酸的产量比原始菌株提高了54％，达到43g/L；Ikeda等(Ikeda M，Nakanishi K，Kino K，et al.Fermentative production of tryptophan by a stablerecombinant strain of Corynebacterium glutamicum with a modified serine-biosynthetic pathway[J]Biosci Biotechnol Biochem，1994，58(4)：674-678)又将丝氨酸代谢途径中的磷酸甘油酸脱氢酶的基因克隆岛表达aroG基因与色氨酸合成酶基因的质粒pWK99中，构建出重组质粒pWK9901，并将后者转入色氨酸生产菌KY10894，解决了发酵过程中丝氨酸供给量较少而积累副产物吲哚等问题，发酵80h后，产量达50g/L。Ikeda等(Ikeda M，Katsumata R.Hyperproduction of tryptophan by Corynebacterium glutamicum with the modified pentosephosphate pathway[J]Applied and environmental microbiology，1999，51(2)：201-206)通过代谢途径分析，发现在产色氨酸的谷氨酸棒杆菌pIK9960中过表达tktA可增加磷酸戊糖途径中E4P的量，从而提高芳香族氨基酸生物合成产率，最终发酵80h色氨酸的产量可达到58g/L。在大肠杆菌方面，日本三乐公司从大肠杆菌K12中取出色氨酸操纵子，组合于载体质粒后，导入大肠杆菌3110，转化株经NTG诱变，得到质粒稳定的6-FT抗性株，再附加8-氮鸟嘌呤抗性，成功选育出L-色氨酸高产株，菌体以葡萄糖和邻氨基苯甲酸为原料进行发酵，培养120h后，产量可达40.3g/L；Berry(Berry A.Improving production of aromatic compounds inEscherichia coli by metabolic engineering[J]Trends Biotechnol，1996，14(7)：250-256)克隆了编码DAHP合成酶的aroG基因以及整个色氨酸操纵子，并对aroG和trpE基因进一步改构，在大肠杆菌中进行高表达，发酵50h后，产量达45g/L；Park等(ParkYH，Lim SJ，Kim BH，etal.E.coli mutant containing mutant genes related with tryptophan biosynthesis and productionmethod of tryptophan by using the same[P].U.S.2008：NO.0299644)通过诱变色氨酸合成途径中的多个基因，成功选育出L-色氨酸的高产株CJ285，发酵61h后，L-色氨酸产量达28.2g/L，糖酸转化率为11.6％。尽管在前人的研究基础上L-色氨酸的产量已有所提高，但还存在发酵周期长、糖酸转化率低等问题，若要满足工业化生产的需求，还需要进一步提高L-色氨酸的产量和糖酸转化率，缩短发酵时间，从而降低生产成本。