[发明专利]一种磁珠富集法筛选芒属植物SSR标记的制备方法及应用

权利要求书

1.一种磁珠富集法筛选芒属植物SSR标记的制备方法，其步骤是：

取芒属植物五节芒幼嫩叶片提取总DNA；

利用限制性内切酶酶切上述步骤a）所提取的总DNA，获得基因组DNA片断，步骤如下：取125ng基因组总DNA5μL，在20μL酶切体系中，用限制性内切酶Mse I于37℃酶切3h，然后65℃温育10min，酶切结束后连接上接头，连接反应为25μL体系，反应在16℃下连接过夜，连有接头的DNA经PCR预扩增获得拷贝，预扩增引物为MseI-N 5’-GAT GAG TCC TGA GTA AN-3’，PCR反应体系25μL；PCR反应程序为：首先95℃预变性5min，然后在94℃变性30 s，53℃退火1 min，72℃延伸1 min； 循环次数16-28个，最后72℃终延伸10min，取3μL扩增产物产物使用1%质量体积比琼脂糖电泳检测，判断产物分布范围及产物量，余下部分置4℃保存备用；

探针与目的片断的杂交，步骤如下：将预扩增产物与生物素标记的探针biotin-(AG)13在分子杂交炉内65℃下杂交2h，杂交反应为100μL体系：20×SSC：0.7μL；0.1%质量体积比SDS：0.7μL；预扩增产物：25μL；Biotin-(AG)13探针：6μL；ddH2O：67.6μL，获得的杂交液置4℃保存备用；

利用磁珠对上述步骤c）中的含有SSR序列的杂交DNA分子进行富集，具体如下：（1）、磁珠预处理：取一管包被有链亲和素的磁珠，拍打管底，然后用枪吹打直至磁珠分离开，用磁力架收集，磁珠悬停30s，吸走上清液；用0.5×SSC洗涤磁珠3次，每次5min，每次洗涤完毕即用磁力架固定磁珠，至磁珠光滑为止，洗好的磁珠置于100μL0.5×SSC中备用；（2）、磁珠富集：将备用杂交液加入到磁珠管中，室温下放置30min，每5min用枪吹打3次，每隔1min用手摇；用磁力架收集去掉上清液；用0.1 X SSC洗涤磁珠3次，每次5min，然后用TEN1000洗涤3次，每次5min，再用300ul TEN1000于65℃预热后，洗涤2min；（3）、目的DNA片段的洗脱：磁珠吸附完毕后，用磁力架固定磁珠，移去杂交混合液，然后再加入100μLTE95℃水浴5min，其间不时吹打均匀；用磁力架固定磁珠后，吸出上清液，置于EP管中标记，再次用150μL TE进行第二次洗脱，用磁力架固定磁珠后，吸出上清液，置于EP管中标记，最后将两次洗脱后的产物冻存于-20℃冰箱备用；（4）、含有SSR序列的DNA片断的PCR扩增：对洗脱后的目的DNA进行PCR扩增，扩增体系为25μL，PCR反应程序为：首先95℃预变性2min，然后在94℃变性30 s，53℃退火1 min，72℃延伸1 min；进行30个循环，最后72℃终延伸10min，取3μL扩增产物产物使用0.8%琼脂糖电泳检测，判断产物分布范围及产物量；

对上述步骤d）中所得含有SSR序列的DNA片断进行扩增并纯化，具体如下：PCR扩增后的产物，切取200bp-750bp的DNA片段范围内的琼脂糖凝胶装在1.5mL离心管中，使用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，回收后的DNA在EB染色的0.8％质量体积比琼脂糖凝胶上电泳，检测回收DNA的质量，置于-20℃保存备用；

将上述步骤e）中所得的DNA片断进行克隆测序；具体方法如下：（1）、目的DNA片断的体外连接：将回收纯化后的PCR产物，使用连接试剂盒进行，反应体系为5μL，16℃连接过夜；（2）、连接产物的转化：采用热激法将已连接目的片断的载体转化入DH-5α感受态细胞；（3）、挑选阳性克隆并测序：用菌落PCR技术筛选阳性克隆，首先使用通用引物SP6/T7进行筛选，排除非阳性克隆，反应体系为25μL，对进行完第一次筛选后的菌液，用MseI-N和不含生物素探针标记的（AG）₁₃为引物进行第二轮PCR扩增筛选，反应体系为25μL，所得PCR产物在0.8%的琼脂糖凝胶上电泳，用DL2000作为marker，挑选不同大小的阳性克隆送样测序；

根据SSR的侧翼序列设计SSR引物，在测序的基础上，利用微卫星DNA两侧的序列的保守性，运用引物设计软件Primer 5.0设计特异性引物，用于扩增该位点的微卫星片断，引物设计：引物长度为18-25bp，退火温度为50-68℃，GC含量为36%-67%，预期PCR扩增产物长度为105-297bp，所述的引物如下：

Mf1

F:ATATGCGTATGGTGTGTATGATGAT

R:AGGTGATAGGTCTAGCCGATGC

Mf2

F:GGTCGTCCGCTCTCCCTGT

R:TCCACGAAGAACTCACTCCAATC

Mf3

F:AAGTTTGTTGATGTGGCGTGAT

R:GGAGAAAGCGAGCGAAGA 

Mf4

F:GCAGGGAGTGAGACAGCT

R:ACATCACATCCTCGTCCA

Mf5

F:CCACACCAGCAGTACTCCAGC

R:GAAAACCTAATAAAAGGGCACGAT

Mf6

F:GCGATGTTGACTTTTGCTGCT

R:GAGCTGCACAACGGGGATTA

Mf7

F:AATCTGTATGTCCCAAACTCACC

R:GTGTTTTGTTCTGGGTGGCTA

Mf8

F:GACCATAGTCCAGAGTATTCGC

R:CATCGACGTCACCAAGAAAT

Mf9

F:TGGGGCGAAGCAGACATAG

R:GTCTGTCCGTTGCCCTGC

Mf10

F:CTGTCGTATGAGCTGCCATC

R:AAACCGGTACGGGTGAATCT

Mf11

F:CTCTCTCCTTTGTTTCCTTTGG

R:CATAAGTAAACGGCTGAACCAC

Mf12

F:TCAAGGAAACAGGTGATAGGTCT

R:ACCTTTTTCAGTCAGCCACAC

Mf13

F:GCGACGAGACAAGGCGCAAGT

R:TAGGCCGGGAAGCGAAGACC

Mf14

F:CAGTCCCAGACTGCATTGAA

R:ATGTCAGCAGTGACCCACAA

Mf15

F:CCAAGGGCTTAGGATTGACA

R:GCCAAGGTACAAGCCGTAGA

Mf16

CCCGCTATGAGCTACAGGAG

CGAGTGCCTACCATCATCCT

Mf17

F:TTCTTGTGCCTGGCTATGAG

R:GACAGAGCAGTGAACCATTTACA

Mf18

F:AGGAGGATAAGAATAATGAGGGTGA

R:TGCTCACAACCACAGAACCG

Mf19

F:ATTTGGCTCATGGGCTGGGT

R:AGGTTAGCACTTAGGGTTTCATCAA

Mf20

F:GCGATGTTGACTTTTGCTGCT

R:GAGCTGCACAACGGGGATTA

Mf21

F:CGACTGGAATTTGGGTAATATGA

R:CCACATGAAGAGGAAGAAAAACTAT

Mf22

F:TTCAACGTGATTAGTGTGAAAGC

R:AGTGGTATGGACGAGATGGTG

Mf23

F:GTGGCGACTCTCCGATACC

R:GCAACCTATGTTCCAAACTTACT

Mf24

F:ATGAAAGGATTAGCCAGAGGTTAG

R:CTTTGCCTGTCTCTCACATCTTG

Mf25

F:ATCAGAGCAAGCAATCAAGAGA

R:TTTATTGTATTTCTGAGCCTCTGTC

Mf26

F:GCAAACGCACGAAGGTAGG

R:CCTCCTTTTCTCACCATTGTCG

Mf27

F:CTTAGAGCGAGAACAACAATTATCC

R:GGCTTGATGAGAACTGAGAGAAAT

Mf28

F:TGCCCGTATTGGATGAAACCTC

R:TGCCACAGCGATGCCGAAT

Mf29

F:AGGAAATGGGGCACAAAAACT

R:GCAGGTGGTTTTCATAAGATTCC

Mf30

F:ACTTCTACACTTCTCCCATGTCCTC

R:CACGGTGAGATTCGGTAGCG

Mf31

F:CCGGGGTGAGAAATCTGTG

R:AAACCAGGGACGGCATAGAT

Mf32

F:AATCTGTATGTCCCAAACTCACC

R:GTGTTTTGTTCTGGGTGGCTA

Mf33

F:TAATGTCTTGTCAGCTTTGAGTTGG

R:AAGAAGAGGTGGAAAGGCAAGTT

Mf34

F:CGACTTTTATTGTAATCGTTATCTC

R:GAGGAACAACTACTGCGGATAC。