[发明专利]一种单细胞凝胶电泳试验检测水质遗传毒性的方法

权利要求书

1.一种单细胞凝胶电泳试验检测水质遗传毒性的方法，其特征是至少包括以下步骤：

（1）用不同浓度的Cr⁶⁺溶液对小老鼠分别进行染毒处理，然后将被不同浓度Cr⁶⁺染毒的小白鼠脾脏的淋巴细胞分别进行单细胞凝胶电泳试验，经制备单细胞悬浮液、制作电泳胶板、细胞裂解、DNA解旋、电泳、中和、染色、镜检与分析等步骤后，用CASP软件分析测量不同浓度Cr⁶⁺染毒的DNA迁移的各种参数；

（2）以Cr⁶⁺浓度为横坐标，olive尾距为纵坐标，绘制Cr⁶⁺对olive尾距的标准曲线；

（3）将小老鼠用浓缩富集的待测水样进行染毒处理，然后将小白鼠脾脏的淋巴细胞用与步骤（1）同样的方法进行单细胞凝胶电泳试验，测量olive尾距；

（4）将待测水样所得的olive尾距代入Cr⁶⁺对olive尾距的标准曲线，即可得到Cr⁶⁺浓度表示的待测水样的水质毒性。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是具体包括以下步骤：

（1）以不同浓度的Cr⁶⁺溶液对小白鼠进行染毒处理；

（2）制备单细胞悬浮液：按常规方法制取小鼠淋巴细胞，用PBS重新悬浮细胞，离心备用； 

（3）制作电泳胶板：吸取150μL0.8wt％的正常熔点琼脂糖滴到载玻片上，加盖玻片，制成底层胶板；将90μL细胞悬浮液和90μL0.7wt％的低熔点琼脂糖混和，迅速滴到底层胶板上得第二层胶；将100μL0.7wt％的低熔点琼脂糖滴到第二层胶上得三层胶，每层胶均在3-5℃固化；

（4）细胞裂解：将步骤（3）中的盖玻片移开，将载玻片浸入0-4℃裂解液中，裂解1-2h；

（5）DNA解旋：将不同浓度铬离子染毒的载玻片水平并列置于电泳槽阳极端，电泳槽中的碱性电泳缓冲液覆过载玻片，放置30-40min；

（6）电泳：调整电泳仪的电压为25V，电泳15-20min；

（7）中和、染色：电泳结束后，加入Tris-HCl缓冲液，将载玻片淹没15-20min，吸干Tris-HCl，再缓缓加入无水乙醇，将载玻片浸埋l-2h，吸取乙醇，存好可用于镜检；

（8）镜检与分析：将各载玻片加入EB染色剂染色后，用荧光显微镜观察，用随机软件在自动曝光条件下拍照获取彗星图像后，用CASP软件分析测量DNA迁移的各种参数；

（9）以Cr⁶⁺浓度为横坐标，olive尾距为纵坐标，绘制Cr⁶⁺对olive尾距的曲线；

（10）将待测水样进行浓缩富集后对小老鼠进行染毒处理，然后按步骤（2）-（8）的方法对小白鼠进行单细胞凝胶电泳试验，测得olive尾距；

（11）将水样染毒的olive尾距代入Cr⁶⁺对olive尾距的曲线，即可得到Cr⁶⁺浓度表示的待测水样的水质毒性。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征是：步骤（1）中，用不同的Cr⁶⁺溶液对小白鼠进行5d的染毒处理。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征是：Tris-HCl缓冲液的浓度为0.4mol/L ，pH为7.5。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征是对水样进行浓缩富集的过程是：取待测水样，以40mL/min的速度用活化后的XAD-2树脂吸附，然后用乙酸乙酯洗脱，洗脱液在50℃下浓缩至所需体积。