[发明专利]一种单细胞凝胶电泳试验检测水质遗传毒性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种水质毒性的检测方法，具体涉及一种利用单细胞凝胶电泳试验使水质遗传毒性可以定量检测的方法。

背景技术

为了保障饮水安全，降低环境恶化给饮用水水质带来的威胁，人们常采用各种方法对水质进行评价，以有效的掌握饮用水引起的健康风险。

常用的检测水质毒性的方法有Ames试验法、微核试验法和单细胞凝胶电泳（SCGE）试验法。SCGE试验法是近年来发展起来的用于检测单个哺乳动物细胞DNA链断裂的新技术，具有敏感、简便、所需样品少等优点，得到了广泛的应用，其相对于Ames试验、微核试验具有一定的优势。虽然SCGE试验法相对于Ames试验法和微核试验法早已作为规范性方法，但单细胞凝胶电泳试验的试验方法和结果分析仍需进一步标准化，在分析结果时仅是采用定性的方法判断毒性物质遗传毒性的大小，不同的人具有不同的判断标准，难于统一，且实验时仅用空白样品作为对照，毒性反应不够直观，因此寻找一种直观、明确、结果易于统一的方法对水质毒性进行检测是水质中毒性物质的定量化评价发展的需求。

发明内容

本发明针对现有水质遗传毒性检测方法的不足，提供了一种单细胞凝胶电泳试验检测水质遗传毒性的方法，该方法将铬离子作为标准毒性物质，在评价水质遗传毒性时以铬离子的浓度表示水质的遗传毒性，实现了水质毒性的定量化，而且检测结果更加直观、明确，易于统一，为水质遗传毒性进行定量化评价提供了有力的支持。

本发明是通过以下措施实现的：

本发明选择六价铬离子作为标准毒性物质，六价铬离子是世界卫生组织致癌物名单中的一种，在生活饮用水卫生标准中属于毒理指标，限值为0.05mg/L，在地表水环境质量标准中也有不同等级的限值，因此用铬离子浓度表示水质毒性结果易于统一，其操作为：首先，用小白鼠用不同浓度铬离子进行染毒，铬离子浓度范围应不引起小白鼠的死亡，能够引起不同大小的olive尾距；然后通过单细胞凝胶电泳实验得到铬离子对olive尾距的标准曲线，然后对待测水样进行单细胞电泳实验，将olive尾距代入标准曲线即可得到用铬离子浓度表示的水样毒性，这种方法避免了其他实验因素所产生的影响，使水质毒性更加准确，检测结果更易于统一。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下步骤：

一种单细胞凝胶电泳试验检测水质遗传毒性的方法，其特征是至少包括以下步骤：

（1） 用不同浓度的Cr⁶⁺溶液对小老鼠分别进行染毒处理，然后将被不同浓度Cr⁶⁺染毒的小白鼠脾脏的淋巴细胞分别进行单细胞凝胶电泳试验，经制备单细胞悬浮液、制作电泳胶板、细胞裂解、DNA解旋、电泳、中和、染色、镜检与分析等步骤后，用CASP软件分析测量不同浓度Cr⁶⁺染毒的DNA迁移的各种参数；

（2） 以Cr⁶⁺浓度为横坐标，olive尾距为纵坐标，绘制Cr⁶⁺对olive尾距的标准曲线；

（3） 将小老鼠用浓缩富集的待测水样进行染毒处理，然后将小白鼠脾脏的淋巴细胞用与步骤（1）同样的方法进行单细胞凝胶电泳试验，测量olive尾距；

（4） 将待测水样所得的olive尾距代入Cr⁶⁺对olive尾距的标准曲线，即可得到Cr⁶⁺浓度表示的待测水样的水质毒性。

上述方法中，其具体包括以下步骤：

（1） 以不同浓度的Cr⁶⁺溶液对小白鼠进行染毒处理；

（2） 制备单细胞悬浮液：按常规方法制取小鼠淋巴细胞，用PBS重新悬浮细胞，离心备用；

（3） 制作电泳胶板：吸取150μL0.8wt％的正常熔点琼脂糖滴到载玻片上，加盖玻片，制成底层胶板；将90μL细胞悬浮液和90μL0.7wt％的低熔点琼脂糖混和，迅速滴到底层胶板上得第二层胶；将100μL0.7wt％的低熔点琼脂糖滴到第二层胶上得三层胶，每层胶均在3-5℃固化；

（4） 细胞裂解：将步骤（3）中的盖玻片移开，将载玻片浸入0-4℃裂解液中，裂解1-2h；

（5） DNA解旋：将不同浓度铬离子染毒的载玻片水平并列置于电泳槽阳极端，电泳槽中的碱性电泳缓冲液覆过载玻片，放置30-40min；

（6） 电泳：调整电泳仪的电压为25V，电泳15-20min；

（7） 中和、染色：电泳结束后，加入Tris-HCl缓冲液，将载玻片淹没15-20min，吸干Tris-HCl，再缓缓加入无水乙醇，将载玻片浸埋l-2h，吸取乙醇，存好可用于镜检；