[发明专利]一种β-1,4-内切木聚糖酶(Xyn11B)基因的克隆及重组酶的制备

权利要求书

1.一种源自宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001的新型木聚糖酶基因(Aus xyn11B)，其完整mRNA和DNA的核苷酸序列分别对应于序列表中的SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。

2.由权利要求1所述的木聚糖酶基因(Aus xyn11B)编码的新型β-1，4-内切木聚糖酶(AusXyn11B)，其完整的氨基酸序列对应于序列表中的为SEQ ID NO：3。

3.Aus xyn11B完整mRNA和DNA序列的获取方法：

(1)Aus xyn11B 3′端mRNA序列的克隆：首先分离纯化宇佐美曲霉E001菌株所产木聚糖酶Aus Xyn11B，并测得蛋白质N端序列；再根据该酶蛋白质N端序列设计两条简并引物Xyn11B-F1和Xyn11B-F2；

Xyn11B-F1：5′-GC(T/C)GG(T/C)AT(T/C)AA(T/C)TA(T/C)GT-3′

Xyn11B-F2：5′-GT(C/G)CA(A/G)AA(T/C)TA(T/C)AA(T/C)GG-3′

以A.usamii E001总RNA为模板，Oligo dT-Adaptor Primer为引物反转录合成cDNA的第一条链；以M13 Primer M4和Xyn11B-F1为引物进行第一轮PCR(94℃2min；30个循环，94℃30s，52℃30s，72℃45s；72℃10min)；以第一轮PCR产物为模板、M13 Primer M4和Xyn11B-F2为引物进行第二轮PCR(94℃2min；30个循环，94℃30s，53℃30s，72℃45s：72℃10min)；目的条带经克隆、测序，得到Aus xyn11B 3′端mRNA序列；

(2)Aus xyn11B 5′端mRNA序列的克隆：基于上述得到的Aus xyn11B 3′端mRNA序列，设计两条反向引物Xyn11B-R1和Xyn11B-R2；

Xyn11B-R1：5′-GTAGGAGCTGGAGCTAGAAGC-3′

Xyn11B-R2：5′-GTACTCTCGTCGTAGGTG-3′

以反转录合成的cDNA第一条链为模板、5′RACE Outer Primer和Xyn11B-R1为引物进行第一轮PCR，其反应条件为：94℃3min，30个循环(94℃30s，53℃30s，72℃45s)，72℃10min；以Inner Primer和Xyn11B-R2为引物进行第二轮PCR，其反应条件为：94℃3min，30个循环(94℃30s，52℃30s，72℃30s)，72℃10min；目的条带经克隆、测序，得到Ausxyn11B 5′端mRNA序列；

(3)Aus xyn11B 5′端启动子序列的克隆：以经处理的A.usamii E001基因组DNA为模板，LP和Xyn11B-R1为引物进行第一轮PCR(94℃4min；30个循环，94℃30s，54℃30s，72℃1min；72℃10min)；LP和Xyn11B-R2为引物进行第二轮PCR(94℃3min；30个循环，94℃30s，51℃30s，72℃45s；72℃10min)；目的条带经克隆、测序，得到Aus xyn11B 5′端启动子序列：

(4)Aus xyn11B 3′端转录终止区序列的克隆：基于上述得到的Aus xyn11B 3′端mRNA序列，设计两条正向引物Xyn11B-F3和Xyn11B-F4；

Xyn11B-F3：5′-GGTTCGGCAATAGCAACTTC-3′

Xyn11B-F4：5′-GCCAGTGTCACGATATCTTC-3′

以处理后的A.usamii E001基因组DNA为模板，LP和Xyn11B-F3为引物进行第一轮PCR扩增(94℃4min；30个循环，94℃30s，53℃30s，72℃45s；72℃10min)；以LP和Xyn11B-F4为引物进行第二轮PCR(94℃3min；30个循环，94℃30s，53℃30s，72℃45s；72℃10min)；目的条带经克隆、测序，得到Aus xyn11B 3′端转录终止区序列。

4.Aus Xyn11B工程菌的构建和表达方法：

(1)含编码Aus Xyn11B成熟肽基因的表达质粒的构建：以M13 Primer M4和Xyn11B-F为引物进行第一轮PCR(94℃2min；30个循环，94℃30s，51℃30s，72℃1min；72℃10min)：以Xyn11B-F和Xyn11B-R为引物第二轮PCR(94℃2min；30个循环，94℃30s，55℃30s，72℃45s；72℃10min)；将第二轮PCR的目的条带进行克隆、测序；测序正确的pUCm-T-xyn11B与pPIC9K质粒均用EcoR I和Not I进行双酶切，回收的酶切产物在T4 DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pPIC9K-xyn11B，并对重组质粒进行序列测定；

(2)GS115/xyn11B的构建、表达、产物纯化及活性测定：用Sal I对pPIC9K-xyn11B进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转化、筛选，得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/xyn11B；该工程菌用1.0％甲醇诱导96h，DNS法测得发酵液中重组木聚糖酶活性达1200IU/mL。离心上清液为重组木聚糖酶粗酶液，经截留分子量为10kDa的超滤膜浓缩，再经DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤层析纯化，纯化后经SDS-PAGE检测为单一条带，并显示重组木聚糖酶分子量为23.3kDa。该重组木聚糖酶最适作用温度50℃，最适作用pH 4.6，该酶在pH 3.0～9.0、50℃以下稳定；金属离子Zn²⁺、Ca²⁺对酶活性有明显的激活作用，而Mn²⁺、Ag⁺则具有很强的抑制作用。