[发明专利]一种β-1,4-内切木聚糖酶(Xyn11B)基因的克隆及重组酶的制备

说明书

技术领域

本发明涉及源自宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001菌株的一种新型β-1，4-内切木聚糖酶基因(xyn11B)完整mRNA和DNA序列的克隆，β-1，4-内切木聚糖酶工程菌的构建以及重组β-1，4-内切木聚糖酶的高效表达和纯化的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

木聚糖酶(xylanases)是一类在木聚糖降解过程中起协同作用的多组分酶系，属于半纤维素酶类，通常是指β-1，4-内切木聚糖酶(endo-β-1，4-xylanase，EC 3.1.2.8)，能从木聚糖主链的内部随机切割木糖苷键，将其降解成寡聚木糖、木二糖和少量木糖。木聚糖酶广泛存在于真核、原核微生物及某些动植物中。近年来，随着对自然界半纤维素资源的开发利用，尤其是低聚木糖优越的生理功能和饲料中抗营养因子的去除，人们对不同来源和不同特性的木聚糖酶进行了较深入地研究，木聚糖酶的应用领域得到了不断地拓展，其在造纸、食品、饲料、纺织、酿酒、医药、环境和能源等工业领域均有较广泛的应用。目前，研究最为深入、应用最为广泛的是来源于曲霉、青霉和木霉等真菌所产的酸性或中性木聚糖酶。近年来，从某些极端生态环境中筛选到一些耐热或/和耐碱菌株，其所产的耐热性或/和耐碱性木聚糖酶已引起人们广泛的关注；同时，某些人工构建的木聚糖酶基因工程菌株，由于其产木聚糖酶活性高、酶系纯、酶学特性符合人们设定的应用要求，也已得到了广泛的应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型β-1，4-内切木聚糖酶基因完整mRNA和DNA序列的克隆和分析，β-1，4-内切木聚糖酶工程菌的构建以及重组β-1，4-内切木聚糖酶的高效表达和纯化的方法。根据Bernard Henrissat等提出的糖苷水解酶分类法，多数木聚糖酶属于糖苷水解酶第10和11家族。生物信息学分析表明该基因所编码的β-1，4-内切木聚糖酶属于A.usamii E001中发现的第二种11家族木聚糖酶，命名为Aus Xyn11B，(其它发现的有：Aus Xyn11A、Xyn11C和Xyn11D)，其相应的基因命名为Aus xyn11B。Aus Xyn11B具有较高的催化活性和热稳定性，有较大的工业化生产和应用潜力以及经济价值。

本发明的技术方案：一种源自A.usamii E001的β-1，4-内切木聚糖酶基因(Aus xyn11B)，其完整mRNA和DNA的核苷酸序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。获取完整mRNA和DNA序列的流程如图1所示。

A.usamii E001菌株由江南大学筛选和保藏，已于2005年在《食品与发酵工业》杂志的Vol.31，No.4，Pg.50公开，本发明人承诺该菌株在20年内向公众发放。

所述的由完整mRNA序列推导的Aus Xyn11B氨基酸序列为SEQ ID NO：3。

所述的重组Aus Xyn11B的活性测定方法：

于25mL具塞试管A和B中，各加入用pH 4.6、柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液配制的质量浓度为0.5％的桦木木聚糖(Sigma，USA)溶液2.4mL，50℃预热10min，在A管中加入0.1mL适当稀释的酶液，50℃反应15min；立即各加入2.5mL 3′，5′-二硝基水杨酸(DNS)试剂，在B管中再补加0.1mL酶液，A和B管均煮沸7min；冷却后各加去离子水5mL，摇匀；540nm处以B管为空白对照测定A管吸光度值，并从木糖标准曲线上查出相应的还原糖(以木糖计)含量并折算成酶活性单位。酶活性单位定义：在本测定条件下，以每分钟产生1μmol还原糖所需的酶量定义为1个木聚糖酶活性单位(IU)。

所述的Aus xyn11B完整mRNA和DNA序列的克隆和表达方法：

(1)木聚糖酶基因(Aus xyn11B)3′端mRNA序列的克隆：首先对A.usamii E001菌株中该木聚糖酶进行分离纯化，并测得Aus Xyn11B N末端序列；再根据该酶蛋白N末端序列设计两条正向简并引物Xyn11B-F1和Xyn11B-F2。

Xyn11B-F1：5′-GC(T/C)GG(T/C)AT(T/C)AA(T/C)TA(T/C)GT-3′

Xyn11B-F2：5′-GT(C/G)CA(A/G)AA(T/C)TA(T/C)AA(T/C)GG-3′