[发明专利]一种从老化病组织中高效分离辣椒疫霉菌的方法

权利要求书

1. 一种从老化病组织中高效分离辣椒疫霉菌的方法，其特征在于：所述方法的具体步聚如下：

（1）辣椒疫病老化病组织的准备：采集辣椒疫病根、茎、果实的老化病组织；

（2）老化病组织表面消毒处理：步骤（1）各部分组织用自来水将表面的土壤及杂物冲洗干净，在无菌超净台内，将各部分组织用无菌水冲洗3次，采用70-80%乙醇进行表面消毒，再用无菌水冲洗3次后，放置于灭菌好的培养皿中，于超净工作台内将表面水分吹干；

（3）黄瓜果的准备：准备健康无病斑的黄瓜果；

（4）黄瓜果表面消毒：将步骤（3）中准备的黄瓜果在自来水下将表面杂物冲洗干净，70-80%乙醇中浸泡0.1-1min，取出后于酒清灯火焰上将表面残留的酒精烧干即可；

（5）老化病组织与黄瓜果共培养：将步骤（4）准备好的黄瓜果用无菌美工刀片在果蒂部位切开一适当大小的开口，将步骤（2）老化病组织夹于步聚（4）黄瓜果开口中，无菌条件下20-30℃保湿培养4-6d；

（6）选择性培养基的制备：取50g黑麦种子在200ml去离子水中浸泡36小时，捣碎机捣碎，60℃水浴2小时，经2层纱布过滤去渣，过滤液补水至1L，加入琼脂粉15g，121℃高压蒸汽灭菌15min，即为黑麦培养基；待黑麦培养基冷却至50℃，加入利福平母液至浓度为100-300mg/L、氨卞青霉素母液至浓度为100-300mg/L和五氯硝基苯母液至浓度为100-300mg/L,混匀，倒平板即为选择性培养基；

（7）辣椒疫霉菌的分离纯化：待步骤（5）黄瓜表面长出白霉层后，直接挑取霉层于步骤（6）选择性培养基上，于20-30℃黑暗条件下培养2-4d，待菌落形成后，挑取少量菌丝在低倍显微镜下观察菌丝形态，确定所分离的菌落为辣椒疫霉菌后，挑取分离出的辣椒疫霉菌少量菌丝，接种在步骤（6）选择性培养基上，15-25℃黑暗条件下培养1-3d，使用无菌手术刀片切割菌落边缘呈放射状单菌丝的尖端，连同培养基一起切下，置于黑麦斜面培养基平板中，生长出来的菌落即为辣椒疫霉菌；

（8）辣椒疫霉菌的保存：将步骤（7）生长出来的辣椒疫霉菌转入黑麦培养基斜面试管中，20-30℃黑暗条件下培养4-6d至长满斜面，灌注灭菌石蜡油，13℃黑暗条件下保存，一年活化转管一次。

2. 根据权利要求1所述的一种从老化病组织中高效分离辣椒疫霉菌的方法，其特征是步骤（2）所述的老化病组织在用自来水冲洗之前应作一些必要的处理：根部和茎部应先用美工刀片将表皮刮除干净；老化病组织在消毒中所采取用的部分不应过大，采用老化病组织各部分的大小如下：根、茎部直径超过0.5cm的要先剖成两半，长度不长于2cm，果实部分切取果肉面积不大于2×2cm；对老化病组织各部分消毒时间如下：根、茎为70-80%乙醇浸泡1-2min，无菌水冲洗3次，果实为70-80%乙醇浸泡0.5-1.5min，无菌水冲洗3次。

3. 根据权利要求1所述的一种从老化病组织中高效分离辣椒疫霉菌的方法，其特征是步骤（3）所述的黄瓜果可以是绿皮的黄瓜果也可以是白皮的黄瓜果，和所种植的黄瓜品种无相关性，只要所使用的黄瓜果是健康无病斑的即可。

4. 根据权利要求1所述的一种从老化病组织中高效分离辣椒疫霉菌的方法，其特征是步骤（5）所述的无菌条件下保湿培养是指将夹好老化组织的黄瓜果置于灭好菌的保鲜盒中，保鲜盒底部铺一层厚度不超过1cm的灭好菌脱脂棉，用无菌水将脱脂棉充分加湿，保鲜盒盖紧后放于25℃生化培养箱中，12h光暗交替培养。

5. 根据权利要求1所述的一种从老化病组织中高效分离辣椒疫霉菌的方法，其特征是步骤（5）所述的利福平、氨卞青霉素和五氯硝基苯母液的配制方法如下：分别称取含有效成分0.5000g的氨卞青霉素原粉、含有效成分0.5000g的利福平原粉、含有效成分0.5000g的五氯硝基苯原粉，分别置于带有标签的50ml灭菌试剂瓶中，氨卞青霉素原粉用蒸馏水溶解并稀释至刻度，五氯硝基苯用适量的甲苯溶解后，用0.1%吐温80水溶液稀释至刻度，利福平原粉用无水已醇溶解并稀释到刻度，配成的药剂母液浓度均为2×10⁴mg/L。