[发明专利]一种从老化病组织中高效分离辣椒疫霉菌的方法

说明书

技术领域

 本发明涉及植物病原菌分离技术领域，具体涉及老化病组织中辣椒疫霉菌的高效分离方法。

背景技术

 辣椒是我国的传统产业，改革开放以来，随着市场经济的推进，我国辣椒产业每年以7%的速度发展，我国辣椒出口也在不断增长，韩国、日本、澳大利亚、美国和东南亚等已成为我国辣椒的常年进口国。由于辣椒的适应性强，栽培区域广泛，种植辣椒的经济效益和社会效益都很高，对于中国蔬菜市场的周年供应有重要意义，辣椒已成为我国部分贫困山区脱贫致富的好帮手、城市菜篮子的当家菜。辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici Leon）是植物的一种重要病原菌，其可侵染辣椒引起根、茎和果实腐烂，在适宜发病条件下，辣椒疫霉菌侵染辣椒可引起毁灭性病害，造成寄主作物绝收。近年来，辣椒疫病在我国不少省份发生为害日益严重，重病田死秧率达30-100%，成为影响我国辣椒生产的重要障碍。除了辣椒疫霉菌外，镰刀菌、青枯菌亦可引起辣椒枯萎和青枯病造成根腐烂，炭疽菌、灰霉菌也能引起辣椒炭疽和灰霉病造成茎和果实腐烂，而且这些病害的症状在作物生长后期或发病后期与辣椒疫霉菌引起的疫病非常接近。目前，分离辣椒疫霉菌的方法主要有病组织直接分离法、带菌土壤或水样诱捕分离法等，其中病组织直接分离法对采集的病样要求比较高，只能从发病症状明显、新鲜的病样上分离到辣椒疫霉菌；带菌土壤或水样诱捕分离法则易受至土壤和水样中其它杂菌的影响，分离效率较低。老化、腐烂的病组织严重复合感染其它杂菌，分离纯化其中的辣椒疫霉菌十分困难，而有关这方面研究还很少。因此，很有必要建立从老化病组织中高效分离辣椒疫霉菌的方法，旨在为开展辣椒疫霉菌的群体遗传研究及揭示病害的传播和发生规律奠定基础，为建立有效的病害防治方法提供理论依据和基础。

发明内容

 为了解决上述问题，本发明的目的是提出一种通过借助健康黄瓜果实从老化病组织中分离辣椒疫霉菌的方法，该方法减轻了辣椒疫病研究人员的工作量，降低了辣椒疫病标本采集的难度，从而实现辣椒疫霉菌的大批量高效分离。

    为达到上述目的，本发明是通过以下技术方案得以实现。

一种从老化病组织中高效分离辣椒疫霉菌的方法，其特征是步聚如下：

（1）辣椒疫病老化病组织的准备：采集辣椒疫病根、茎、果实等老化病组织；

（2）老化病组织表面消毒处理：步骤（1）各部分组织用自来水将表面的土壤及杂物冲洗干净，在无菌超净台内，将各部分组织用无菌水冲洗3次，采用70-80%乙醇进行表面消毒，再无菌水冲洗3次后，放置于灭菌好的培养皿中，于超净工作台内将表面水分吹干；

（3）黄瓜果的准备：准备健康无病斑的黄瓜果；

（4）黄瓜果表面消毒：将步骤（3）中准备的黄瓜果在自来水下将表面杂物冲洗干净，70-80%乙醇中浸泡0.1-1min，取出后于酒清灯火焰上将表面残留的乙醇烧干即可；

（5）老化病组织与黄瓜果共培养：将步骤（4）准备好的黄瓜果用无菌美工刀片在果蒂部位切开一适当大小的开口，将步骤（2）老化病组织夹于步聚（4）黄瓜果开口中，无菌条件下20-30℃保湿培养4-6d；

（6）选择性培养基的制备：取50g黑麦种子在200ml去离子水中浸泡36小时，捣碎机捣碎，60℃水浴2小时，经2层纱布过滤去渣，过滤液补水至1L，加入琼脂粉15g，121℃高压蒸汽灭菌15min，即为黑麦培养基。待黑麦培养基冷却至50℃，加入利福平母液至终浓度为100-300mg/L、氨卞青霉素母液至终浓度为100-300mg/L和五氯硝基苯母液至终浓度为100-300mg/L,混匀，倒平板即为选择性培养基。

（7）辣椒疫霉菌的分离纯化：待步骤（5）黄瓜表面长出白霉层后，直接挑取霉层于步骤（6）选择性培养基上，于20-30℃黑暗条件下培养2-4d，待菌落形成后，挑取少量菌丝在低倍显微镜下观察菌丝形态，确定所分离的菌落为辣椒疫霉菌后，挑取分离出的辣椒疫霉菌少量菌丝，接种在步骤（6）选择性培养基上，15-25℃黑暗条件下培养1-3d，使用无菌手术刀片切割菌落边缘呈放射状单菌丝的尖端，连同培养基一起切下，置于黑麦斜面培养基平板中，生长出来的菌落即为辣椒疫霉菌。

（8）辣椒疫霉菌的保存：将步骤（7）生长出来的辣椒疫霉菌转入黑麦培养基斜面15×150mm的试管中（试管斜面不应过长，试管长度的1/3为宜），20-30℃黑暗条件下培养4-6d至长满斜面，灌注高于试管斜面1.5cm的灭菌石蜡油，13℃黑暗条件下保存，一年活化转管一次。