[发明专利]一种纯化重组人胰岛素原的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种纯化重组人胰岛素原的方法，特别涉及了一种利用大孔吸附树脂和阳离子交换树脂纯化重组人胰岛素原的方法。

背景技术

胰岛素是至今仍无法替代的针对糖尿病的特效药，现在全球的糖尿病患者超过1.2亿，并且每年这个数字都在递增，预计到2025年为3亿，每个糖尿病患者每天需要使用胰岛素1.5～2.0毫克，全球每年要消耗胰岛素5000公斤左右。因此研发低成本大规模制备胰岛素的方法势在必行。

胰岛素是由胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白质激素，是机体内唯一降低血糖的激素。目前众多专利中，公开了大量胰岛素衍生物或类似物以及相应的制法(CN1043719A，CN1068501A，CN1126761A，CN1126761A，CN1175106C，CN1247616C)，这些制法分为直接化学合成法和基因重组法，基因重组法包括利用大肠杆菌的包涵体制备方法(CN1059703C，ZL98812757.1，CN1663960A等)和利用酵母细胞的分泌制备方法(CN100432104C，CN1873006A，CN101029077B等)。

在制备胰岛素的过程中，胰岛β细胞先合成一个大分子的前胰岛素原，然后加工成86肽的胰岛素原，再经水解而成为胰岛素。胰岛素原包含组成胰岛素的A、B链和一条在加工成成熟的胰岛素过程中被切除的C肽，构型如下：前肽-B-Arg Arg-C-Lys Arg-A。中国发明专利申请CN101717442A公开了聚乙二醇化重组人DesB30胰岛素及其制备方法和应用的技术方案，该技术方案中重组表达载体的宿主细胞为毕赤酵母，而关于胰岛素原的纯化方法为发酵液过滤后经大孔吸附树脂吸附后用60％的乙醇洗脱，然后经强阳离子交换层析进一步纯化，纯化后再经过氯化锌沉淀，收集胰岛素原沉淀重新溶解后用于酶切得到胰岛素，该方案制备胰岛素原的生产工艺较繁琐，胰岛素原最终以沉淀的形式存在，不利于酶切步骤的直接进行。

中国发明专利说明书CN88102311.6公开了一种人结晶胰岛素原及其生产方法，该技术方案首先在含有人胰岛素原溶液中加入阳离子盐，再调节pH为5.4～6.5，使晶体生成，然后回收结晶的人胰岛素原，该方法虽然简化了生产工艺，但是产品收率低，而且胰岛素原仍旧以沉淀形式存在。中国发明专利说明书ZL98812757.1公开了人胰岛素原的制备方法，该技术方案为：包涵体先经过溶解和磺化，再经过溴化氰处理和离子交换层析纯化后复性，重折叠正确的人胰岛素原经吸附色谱层析，然后经氯化锌沉淀得到以沉淀形式存在的人胰岛素原，可以获得90％的产率，该方法生产工艺复杂，产品仍以沉淀形式存在。

以上所公开的方法中操作工艺复杂，胰岛素的前体胰岛素原最终以沉淀的形式存在，不利于后续酶切步骤直接操作，工艺衔接性差，而且胰岛素原的收率和纯度不能同时兼顾。因此，需要开发一种纯化效率高、衔接性好，而且更为简便有效的工艺来制备胰岛素原，以利于大规模制备胰岛素。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，简化大肠杆菌发酵重组人胰岛素原纯化步骤，提高胰岛素原的收率和纯度，增强工艺间的衔接性，发明人利用重组人胰岛素原可以被大孔吸附树脂吸附浓缩，并且在酸性条件下可被阳离子交换树脂吸附，而在碱性条件下解吸附的特点。本发明提供了一种纯化重组人胰岛素原的方法，包括大孔吸附树脂层析和阳离子交换树脂层析。

首先，将含有重组人胰岛素原基因的大肠杆菌工程菌经发酵、离心、破菌，收集到包涵体后洗涤，溶解后复性得到重组人胰岛素原复性液。

本发明中大孔吸附树脂层析具体步骤为：

用去离子水(乙酸调pH为3.0～5.0)平衡大孔吸附树脂，将重组人胰岛素原复性液(盐酸调pH为3.0～5.0)上样至大孔吸附树脂层析柱，上样流速为200～500cm/h，再用去离子水(乙酸调pH为3.0～5.0)清洗5～10个柱体积，清洗流速为200～500cm/h，最后用浓度为65％～95％的乙醇(乙酸调pH为3.0～5.0)解吸附洗脱，洗脱流速为50～200cm/h，收集解吸附洗脱液。

本发明对大孔吸附树脂类型进行了优选，优选地，上述大孔吸附树脂为D-101、D1300、X-5型大孔吸附树脂，更优选为D-101型大孔吸附树脂。

本发明对大孔吸附树脂层析柱的径高比进行了优选，优选地，上述层析柱的径高比为1∶5～20，更优选为1∶10～15。