[发明专利]一种筛选ε-聚赖氨酸产生菌的方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物发酵工程领域，具体涉及一种简便快捷的ε-聚赖氨酸产生菌筛选方法。

背景技术

ε-聚赖氨酸（ε-polylysine）是目前天然防腐剂中具有优良防腐性能和巨大商业潜力的微生物类食品防腐剂，通常由25-35个赖氨酸残基聚合而成，是链霉菌、北里孢菌和麦角真菌等微生物的天然代谢产物。与传统的食品防腐剂相比，其抗菌谱广，在中性和微酸性条件下，对大部分革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、真菌等都有抑制作用；其安全无毒，不但对人体健康无害，而且分解代谢后还具有一定的营养价值；此外还具有水溶性好、热稳定性好等特点。ε-聚赖氨酸在日本、韩国被广泛应用于食品防腐剂。2003年10月，美国FDA将其规定为GRAS，认可其为世界标准级的食品添加剂。迄今为止，ε-聚赖氨酸在日本已实现工业化生产，产量高达50 g/L左右。我国目前对ε-聚赖氨酸的研究基本还处于实验室阶段，商业化生产也刚处于起步阶段，目前只有浙江银象公司将ε-聚赖氨酸投入生产。如果加大在该领域的技术研究，势必将产生巨大的经济效益，因此，开展对ε-聚赖氨酸生产技术的研究具有重要的意义。

ε-聚赖氨酸产生菌的筛选方法复杂，目前普遍采用2002年日本学者Nishikawa的方法，即在培养基中加入一定浓度的碱性染料亚甲基蓝，通过带正电的亚甲基蓝与同样带正电的ε-聚赖氨酸相互间的静电排斥，产生肉眼可见的透明圈来初筛目的菌株，然后再通过摇瓶发酵，从发酵液中检验是否呈Dragendorff阳性反应。这种筛选方法虽然定向，较为简便，但是在培养基中加入亚甲基蓝后对目的菌株有一定的毒害性，会抑制其生长，且所有产透明圈菌株均需通过摇瓶发酵复筛验证，工作量大，周期较长。

发明内容

       本发明克服了现有技术的不足之处，提供一种简便快捷的ε-聚赖氨酸产生菌筛选方法，该方法在初筛培养基中不添加任何带电荷的指示剂，并利用Dragendorff试剂与产透明圈菌株周围产生砖红色聚集圈的表观来灵敏地筛选目的菌株。

       实现本发明的技术方案是：

一种筛选ε-聚赖氨酸产生菌的方法在初筛培养基表面加入Dragendorff试剂，通过与产透明圈的菌株周围形成砖红色聚集圈来筛选ε-聚赖氨酸产生菌。包括如下步骤：

(1)   将适当稀释后的土壤悬液涂布在含有50 mg/L-100 mg/L重铬酸钾的初筛培养基上，28-30℃培养5-7d；挑取产生透明圈的单菌落，置于斜面培养基上30℃培养5-7天，4℃保藏。

(2)   滴加Dragendorff试剂到初筛培养基上产生透明圈的单菌落，静置，观察菌株周围的颜色变化，其中周围能与Dragendorff试剂形成明显砖红色聚集圈的产透明圈菌株为ε-聚赖氨酸产生菌。

所述的初筛培养基不加任何带电荷的指示剂。步骤（2）所述的Dragendorff试剂是以滴加的形式覆盖整个培养基表面；滴加Dragendorff试剂后，应静置20-30 min再观察菌株周围的砖红色聚集圈。

可以采用以下优选方法：（1）将适当稀释后的土壤悬液涂布在含有50 mg/L重铬酸钾的初筛培养基上，30℃培养5-7d，挑取产生透明圈的单菌落到斜面培养基保藏；（2）滴加适量的Dragendorff试剂到含有产透明圈菌株的初筛培养基表面，使其覆盖整个平板，静置数分钟后观察菌株周围的颜色变化。周围能与Dragendorff试剂形成明显砖红色聚集圈的产透明圈菌株为ε-聚赖氨酸产生菌。

初筛培养基和斜面培养基均包括碳源、氮源和无机盐成分。可分别采用如下组分：

初筛培养基（w/v）：葡萄糖1%~5%，(NH₄)₂SO₄ 0.1%~0.5%，NaH₂PO₄·12H₂O 0.1%~0.3%，MgSO₄·7H₂O 0.05%~0.1%，琼脂1.5%~2%，余量为水。pH 6.8~7.0，1×10⁵ Pa灭菌30 min。