[发明专利]一种土壤胞外蛋白质的提取分离方法

权利要求书

1.一种土壤胞外蛋白质的提取分离方法，其特征在于：所述方法的具体步骤如下：

（1）土壤胞外蛋白质提取：

称取4-6g土壤于50mL的离心管中，加入0.05mol/L，pH8.0的柠檬酸钠缓冲液16-24mL，于漩涡振荡器中振荡3-4小时，期间每隔15分钟置于冰上冷却5分钟，16000rpm离心30min；取上清液过0.45μm的滤膜，取滤液添加pH为8.0的Tris-饱和酚8-12mL，置于漩涡振荡器中振荡5-20min，静置25-50min，16000rpm离心30min；取下层酚相，加入5倍体积预冷至4^oC的0.1mol/L甲醇-醋酸铵溶液，置于-20^oC条件下沉淀、过夜，然后16000rpm离心30min；弃上清液，用10-15mL甲醇洗涤沉淀，16000rpm离心30min，去除上清液，用10-15mL丙酮洗涤沉淀2次，每次洗涤后于16000rpm离心30min；将沉淀于超净台中吹干，获得蛋白质干粉；

（2）土壤胞外蛋白质分离：

取1.2mg蛋白质干粉，加入300μl蛋白质裂解液，制成蛋白质样品，进行双向电泳分离。

2.根据权利要求1所述的一种土壤胞外蛋白质的提取分离方法，其特征在于：步骤（2）所述双向电泳的具体步骤为：

选取24cm IPG胶条，加入蛋白质样品后置于水化盘上水化12-24小时，然后放入IPGphor等电聚焦仪中，等电聚焦仪电泳参数为500V，1小时、1000V，6小时、8000V，7小时、3000V，10-30小时；等电聚焦结束后，将胶条分别置于平衡缓冲液Ⅰ和平衡缓冲液Ⅱ中，各平衡15分钟后进行SDS-PAGE电泳；SDS-PAGE电泳凝胶底层为10%分离胶，用0.8-1%的琼脂糖溶液封住胶条表面，以15mA恒定电流进行电泳，电泳温度保持在15-20^oC，电泳时间为7-9小时；电泳结束后，卸下胶片，胶片经固定、水洗、染色、脱色，最后用扫描仪扫描。