[发明专利]一种土壤胞外蛋白质的提取分离方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种土壤胞外蛋白质的提取分离方法，属于生物技术领域。

技术背景

环境宏蛋白质组学是近年来新出现的一种概念和研究技术，该技术可将土壤中复杂的生物群体有效地进行结合并分析，为充分及深入揭示土壤生态系统变化提供了有力的技术保障。

环境宏蛋白质组学研究的关键问题在于，土壤中蛋白质的提取与分析，其中土壤胞外蛋白质的提取是环境宏蛋白质组学研究的重点。土壤胞外蛋白质包含着，种植于土壤中的植物、土壤中的微生物、动物等在环境影响下分泌的蛋白质，而这些蛋白质在植物、微生物、动物的相互联系中起着关键的作用。因此土壤胞外蛋白质的提取是环境宏蛋白质组学研究的前提，然而由于土壤蛋白质提取方法的缺乏，当前土壤蛋白质组学研究还未能有效地开展。因此开发一种有效提取土壤胞外蛋白质的方法对于环境宏蛋白质组学研究的研究具有极其重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种有效的土壤胞外蛋白质的提取分离方法。

本发明的土壤胞外蛋白质的提取分离方法，具体方法如下：

（1）土壤胞外蛋白质提取：

称取4-6g土壤于50mL的离心管中，加入0.05mol/L，pH8.0的柠檬酸钠缓冲液16-24mL，于漩涡振荡器中振荡3-4小时，期间每隔15分钟置于冰上冷却5分钟，16000rpm离心30min；取上清液过0.45μm的滤膜，取滤液添加pH为8.0的Tris-饱和酚8-12mL，置于漩涡振荡器中振荡5-20min，静置25-50min，16000rpm离心30min；取下层酚相，加入5倍体积预冷至4^oC的0.1mol/L甲醇-醋酸铵溶液，置于-20^oC条件下沉淀、过夜，然后16000rpm离心30min，弃上清液，用10-15mL甲醇洗涤沉淀，16000rpm离心30min，去除上清液，用10-15mL丙酮洗涤沉淀2次，每次洗涤后于16000rpm离心30min，将沉淀于超净台中吹干，获得蛋白质干粉。

（2）土壤胞外蛋白质分离：

取1.2mg蛋白质干粉，加入300μl蛋白质裂解液，制成蛋白质样品，进行双向电泳分离。

双向电泳的具体步骤：选取24cm IPG胶条，加入蛋白质样品后置于水化盘上水化12-24小时，然后放入IPGphor等电聚焦仪中，等电聚焦仪电泳参数为500V，1小时、1000V，6小时、8000V，7小时、3000V，10-30小时；等电聚焦结束后，将胶条分别置于平衡缓冲液Ⅰ和平衡缓冲液Ⅱ中，各平衡15分钟后进行SDS-PAGE电泳；SDS-PAGE电泳凝胶底层为10%分离胶，用0.8-1%的琼脂糖溶液封住胶条表面，以15mA恒定电流进行电泳，电泳温度保持在15-20^oC，电泳时间为7-9小时；电泳结束后，卸下胶片，胶片经固定、水洗、染色、脱色，最后用扫描仪扫描。

本发明的显著优点：

1、国际上首次提出土壤胞外蛋白质提取方法。

2、提取的土壤胞外蛋白质经SDS-PAGE检测后条带清晰。

3、提取的土壤胞外蛋白质经双向电泳分离后蛋白质点清晰。

附图说明

图1为采用本发明方法提取的土壤胞外蛋白质的SDS-PAGE图，其中1表示水稻土壤，2表示甘蔗土壤，3表示烟草土壤；

图2为采用本发明方法分离的水稻土壤胞外蛋白质的双向电泳图。

具体实施方式

本发明的土壤胞外蛋白质的提取分离方法，具体方法如下：

（1）土壤蛋白质提取剂的配置：

100mL的0.05mol/L的柠檬酸钠缓冲液配置方法：称取1.4705g 2水合柠檬酸钠采用双蒸水溶解并定溶至100mL，并用0.1mol/L的NaOH溶液调节pH值为8.0；100mL的0.1mol/L的NaOH溶液配制方法：称取0.4g NaOH，采用双蒸水溶解并定溶至100mL。

10mL的SDS凝胶缓冲液配置方法：首先称取0.121g Tris定容到1mL，加入浓HCL调pH值到6.8，其次加入0.25g SDS，0.31g 二硫苏糖醇（DTT），2mL甘油，0.02g溴酚蓝加水定容至10ml。

5mL的蛋白质裂解液配置方法：称取0.76g硫脲、2.1g尿素、0.05g二硫苏糖醇、0.2g 3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸（CHAPS）于10mL离心管中，加双蒸水溶解并定容至5mL。