[发明专利]一种Bt蛋白体外抗虫鉴定的方法

权利要求书

1.一种Bt蛋白体外抗虫鉴定的方法，包括以下步骤：

（1）将待鉴定的Bt基因克隆进原核表达载体PET-28B中；

（2）将含有Bt基因的原核表达载体PET-28B转入大肠杆菌BL21中；

（3）诱导培养含Bt基因的大肠杆菌BL21产生Bt蛋白；

（4）收集分离上步所得菌体，加溶菌酶后破碎菌体，分离提取BT蛋白；

（5）以玉米螟为受试昆虫，将上步提取的Bt蛋白掺入玉米螟饲料中，饲喂试验组玉米螟，同时分别以蒸馏水、含空原核表达载体的大肠杆菌BL21菌液掺入玉米螟饲料中饲喂对照组玉米螟，同样的条件下饲养8～10天后统计死亡率和虫体重量，进而确定Bt蛋白的杀虫效果。

2.根据权利要求1所述Bt蛋白体外抗虫鉴定的方法，其特征在于，在所述步骤（3）中，诱导产生Bt蛋白的具体方法如下：

（1）在无菌环境下，用接种环沾取少量含有Bt基因原核表达载体的大肠杆菌BL21菌液在含有卡那霉素的LB平板上划线分离单菌落；划线后将LB平板放入37℃恒温培养箱中倒置培养；

（2）无菌环境下，挑取上步所得大肠杆菌BL21单菌接种于含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃下摇动培养过夜；

（3）将菌液以1：100接种到含卡那霉素的LB液体培养基中摇动培养，培养至OD₆₀₀=0.5；

（4）在OD₆₀₀已经达到0.5时加入IPTG至终浓度0.5mM继续摇动诱导4小时；

（5）收集诱导后的菌液，4000rpm离心10分钟，弃上清，收集菌体。

3.根据权利要求1所述Bt蛋白体外抗虫鉴定的方法，其特征在于，在所述步骤（3）中，按如下方法提取Bt蛋白；

（1）收集上步诱导后的菌液，4000rpm离心10分钟，弃上清，收集菌体；

（2）在收集的菌体中加入裂解缓冲液重新悬浮，加入溶菌酶至终浓度1mg/ml，冰上放置30分；

（3）超声波破碎菌体，4000rpm离心10分，收集上清。

4.根据权利要求1所述Bt蛋白体外抗虫鉴定的方法，其特征在于，在所述步骤（5）中，按如下方法喂养玉米螟：

（1）在26～28℃，相对湿度70%的环境条件下孵化玉米螟虫卵；

（2）孵化的玉米螟幼虫在26～28℃、相对湿度70%条件下进行人工饲养，饲喂人工饲料。

5.根据权利要求4所述Bt蛋白体外抗虫鉴定的方法，其特征在于，以重量份计，所述人工饲料由下述A、B、C、D四组原料制成：

A：大豆面12份，玉米面12份，酵母粉7.2份；

B：葡萄糖 6份，蔗糖 1份，Vc 0.4份，水36份或含待鉴定Bt蛋白的上清液36份；

C：玉米粉3.2份，水8份；

D：琼脂1.2份，山梨酸0.4份，水48份；

先将A组中的三种原料混匀混合；将B组中的葡萄糖、蔗糖、Vc混合后加入36份水中；取另一容器将C组原料混合均匀；再将D组中的琼脂1放入48份水中，加热至沸腾后加入将混匀的C组原料，随后加入山梨酸，再等其降温至50℃时加入混合后的A、B组混合物，搅拌均匀，待凝固后切成长条使用。