[发明专利]一种Bt蛋白体外抗虫鉴定的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物基因工程领域，具体涉及一种Bt蛋白体外抗虫鉴定的方法。

背景技术

Bt基因编码杀虫晶体蛋白，来自苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringHansis）。它在芽孢形成过程中产生δ-内毒素的杀虫伴胞晶体蛋白，这些蛋白具有很高的杀虫活性。其作用原理为这种抗虫蛋白能被碱性肠液溶解，水解为更小的活性毒素片段—核心片段（Hofte和Whiteley,1989）。该活性片段能抗蛋白酶的进一步水解，被激活的蛋白质结合在昆虫肠道上的刷状小泡上，引起穿孔从而影响渗透平衡，细胞膨胀并溶解，靶标生物停止取食并最后死亡。研究表明许多靶标害虫的肠道上皮细胞都具有Bt蛋白高亲和性的结合位点（Hofte和Whiteley,1989）。苏云金芽孢杆菌因其杀虫效果好、安全、高效等优点而成为应用最为广泛的杀虫微生物。随着植物细胞生物学和分子生物学的发展，利用基因工程技术将外源抗虫基因Bt导入玉米，使玉米自身产生抗虫蛋白而达到抗虫的目的。

利用基因工程技术将外源抗虫基因Bt导入玉米，得到的转基因苗进行抗虫性鉴定是最直接的抗虫鉴定方法。但是因为转基因整个周期比较长，如果克隆、或改造的Bt基因抗虫性较差，不但浪费人力、物力，更是影响了实验进程。因此如何快速有效地检测Bt基因的抗虫性鉴定，对于Bt蛋白的应用具有重要的实用价值。Bt蛋白的体外抗虫鉴定技术成为首要解决的问题。

Bt蛋白的体外抗虫鉴定的方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳技术依据苏云金杆菌的杀虫活性主要是由杀虫蛋白基因型和产生的伴孢晶体的量所决定的，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测出Bt蛋白的含量，测定Bt蛋白的含量，也能指示该蛋白相应的毒力活性。但是该方法只是能检测出Bt蛋白含量，Bt蛋白实际效果最终还是要进行生物测定，才能准确鉴定出Bt蛋白的抗虫性。

另外，如何获得大量的实验虫源是进行Bt蛋白体外鉴定的基础，1980年周大荣等研发了亚洲玉米螟半人工饲料-新7号饲料，其后宋彦英等用代号为JSMD的物质取代新7号饲料中的琼脂取得成功，同时研究亚洲玉米螟的一些学者，在饲养亚洲玉米螟时也对饲料配方进行了一些改进。然而现有这些玉米螟人工饲料仍有改进的必要，以获得一致性较好的标准试虫。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种Bt蛋白体外抗虫鉴定的方法，该方法操作简单，快速，不受时间和季节限制、经济成本低。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

将Bt基因连接到原核表达载体pET-28B上，将含有Bt基因的原核表达载体转入大肠杆菌BL21中，进行诱导表达Bt蛋白，提取诱导表达出的Bt蛋白，将此Bt蛋白拌入玉米螟幼虫人工饲料中喂养玉米螟幼虫，数天后统计玉米螟幼虫的死亡率和生长状况。该方法操作简单，快速，不受时间和季节限制、经济成本低，能快速地进行Bt蛋白抗虫鉴定。

一种Bt蛋白体外抗虫鉴定的方法，包括以下步骤：

（1）将待鉴定的Bt基因克隆进原核表达载体PET-28B中；

（2）将含有Bt基因的原核表达载体PET-28B转入大肠杆菌BL21中；

（3）诱导培养含Bt基因的大肠杆菌BL21产生Bt蛋白；

（4）收集分离上步所得菌体，加溶菌酶后破碎菌体，分离提取BT蛋白；

（5）以玉米螟为受试昆虫，将上步提取的Bt蛋白掺入玉米螟饲料中，饲喂试验组玉米螟，同时分别以蒸馏水、含空原核表达载体的大肠杆菌BL21菌液掺入玉米螟饲料中饲喂对照组玉米螟，同样的条件下饲养8～10天后统计死亡率和虫体重量，进而确定Bt蛋白的杀虫效果。

在所述步骤（3）中，诱导产生Bt蛋白的具体方法如下：

（1）在无菌环境下，用接种环沾取少量含有Bt基因原核表达载体的大肠杆菌BL21菌液在含有卡那霉素的LB平板上划线分离单菌落；划线后将LB平板放入37℃恒温培养箱中倒置培养；

（2）无菌环境下，挑取上步所得大肠杆菌BL21单菌接种于含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃下摇动培养过夜；

（3）将菌液以1：100接种到含卡那霉素的LB液体培养基中摇动培养，培养至OD₆₀₀=0.5；

（4）在OD₆₀₀已经达到0.5时加入IPTG至终浓度0.5mM继续摇动诱导4小时；

（5）收集诱导后的菌液，4000rpm离心10分钟，弃上清，收集菌体。

在所述步骤（3）中，按如下方法提取Bt蛋白；