[发明专利]一种便于外源蛋白纯化的原核表达载体及构建方法

权利要求书

1.一种原核表达载体pET-EM，其特征在于它的结构如图1所示。

2.一种构建原核表达载体pET-EM的方法，其特征在于具体构建步骤包括：

1）用限制性核酸内切酶SapI和BglI酶切载体pET30a，大片段连接后，获得载体pET30a’；

2）引物设计及基因扩增：

a.根据Mxe gyrA内含肽设计一对正反向引物P1和P2，

P1：5’TCCATATGGGTACCCCATGGGCTAGCTCTAGAGGCTCTTCCTGCA

TCACGGGA3’；P2：5’TTGATATCAGAGCGTGGCTGACGAACCCG3’；

其中P1的5'端引入NdeI、KpnI、NcoI、NheI、XbaI、SapI限制性核酸内切酶酶切位点，该些酶切位点构成一多克隆位点，供外源基因的插入；P2的5’端引入EcoRV限制性核酸内切酶酶切位点，为构建质粒提供连接端；

b.在P1、P2的作用下，以pYTB11质粒为模板扩增出Mxe gyrA基因；

3）将扩增的Mxe gyrA基因，经 NdeI、EcoRV限制性内切酶酶切后连入载体pET-30a’相应的位点，构建载体pET-M；

4）NdeI限制性内切酶酶切pET-EI-GFP质粒，末端补平后，用SacI酶切，获得的DNA片段与SacI和EcoRV双酶切的pET-M载体连接，构建携带多克隆位点、Mxe gyrA内含肽及ELP基因的重组载体pET-EM。

3.按权利要求2所述的载体构建方法，其特征在于步骤1）中SapI和BglI酶切后获得的大片段及步骤4）中NdeI限制性内切酶酶切产物用Klenow大片段DNA聚合酶补平其粘性突出端。

4.按权利要求2所述的载体构建方法，其特征在于步骤1）、3）、4）连接时所用的DNA连接酶为T4 DNA连接酶。