[发明专利]一种便于外源蛋白纯化的原核表达载体及构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种便于进行外源蛋白表达纯化的原核表达载体的构建方法及应用示范。

背景技术

利用原核表达系统体外表达某些特定的蛋白是常用的蛋白生产手段之一，其最大的优点为蛋白产量高、操作简便，目前已有不少成熟的原核表达系统。传统的重组蛋白表达与纯化通常是在目的蛋白前或后加上特定的标签（如GST tag、His tag等），形成的融合蛋白可借助蛋白标签进行亲和层析，层析柱价格昂贵，使得蛋白纯化成本较高，且纯化的融合蛋白往往需进行体外裂解去除蛋白标签后才能获得很好生物学活性的目的蛋白，常用的裂解方法主要有化学裂解法（如溴化氰、羟胺、BNPS-3-甲基吲哚等）和酶解法（如Xa因子、凝血酶、肠激酶、胶原酶、凝乳酶等）。化学裂解虽价廉、有效，但由于裂解位点特异性低，还可能对目的蛋白产生不必要的修饰，该方法逐渐被酶解法代替，而酶解去除标签，所用的裂解酶价格不但高，还不可避免地混入目的蛋白中，造成新的污染，使得蛋白纯化更加复杂。由于上述原因，最终获得均一的目的蛋白成本高、周期长，成为制约体外规模化生产目的蛋白的瓶颈性问题。

内含肽（Intein）是蛋白质前体内的肽段，在蛋白质成熟过程中通过精准的自我剪切以及两侧序列的拼接，从而实现宿主蛋白的成熟。1987年于Neurospora crassa液泡ATP酶中最早被发现，1989年以后才被Anraku实验室逐渐证实其功能，目前已经发现210个以上的内含肽，主要分布在低等真核生物、细菌以及病毒的蛋白质中。随着对内含肽剪接机制的深入研究，在蛋白质工程及其他生物技术领域表现出越来越广阔的应用前景，尤其蛋白纯化方面，内含肽的发现和应用使得重组蛋白的表达和纯化得到大大改进，将其与其它蛋白标签，如CBD （Chitin-binding dimain）融合，可通过亲和层析等方法获得融合蛋白，再利用内含肽的自我剪切功能获得不含任何外源序列的目的蛋白。目前已构建成功多个内含肽的突变体，可以使得其在特定的条件下（如特定温度，加入硫醇等）发生一侧性剪切，大大提高蛋白纯化效率和纯度，通过亲和层析和内含肽介导的方法，Mills等人成功纯化出QACA蛋白，Zhao等人成功纯化出绿色荧光蛋白。虽然该方法操作简便，但仍需要使用价格较高的亲和层析柱，这将重组蛋白的生产成本又推至一定的高度。

发明内容

为了解决现有技术的问题，本发明提供一种新的原核表达载体，该载体适用于外源重组蛋白的表达、纯化，且纯化操作简便、纯化成本低，对重组蛋白的规模化生产有着很好的应用前景。

本发明所说的原核表达载体是pET-EM，它是在 pET30a基础上引入合适的多克隆位点及Mxe gyrA内含肽、ELP基因，构建得到的新原核表达载体，pET-EM结构如图1所示。

本发明还公开了pET-EM的构建方法，具体包括以下步骤：

1）用限制性核酸内切酶SapI和BglI酶切载体pET30a，大片段连接后，获得载体pET30a’；

2）引物设计及基因扩增：

a.根据Mxe gyrA内含肽设计一对正反向引物P1和P2，

P1：5’-TCCATATGGGTACCCCATGGGCTAGCTCTAGAGGCTCTTCCTGCA

TCACGGGA-3’（SEQ ID NO.1）；

P2：5’-TTGATATCAGAGCGTGGCTGACGAACCCG-3’ （SEQ ID NO.2）;

其中P1的5'端引入NdeI、KpnI、NcoI、NheI、XbaI、SapI限制性核酸内切酶酶切位点，该些酶切位点构成一多克隆位点，供外源基因的插入；P2的5’端引入EcoRV限制性核酸内切酶酶切位点，为构建质粒提供连接端；

b.在P1、P2的作用下，以pYTB11质粒为模板扩增出Mxe gyrA基因；

3）将扩增的Mxe gyrA基因，经 NdeI、EcoRV限制性内切酶酶切后连入载体pET-30a’相应的位点，构建载体pET-M；