[发明专利]一种碱性低温蛋白酶海洋菌株、低温碱性蛋白酶及其生产方法

权利要求书

1.一种碱性低温蛋白酶海洋菌株，其为交替假单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)B8453013，2009年9月14日保存于中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.：3281。

2.一种碱性低温蛋白酶，生产该蛋白酶的DNA的核苷酸序列如序列<400>1所述。

3.根据权利要求2所述的碱性低温蛋白酶，其酶学特征为：

1)最适反应温度为25℃，在25℃-30℃范围内酶活力高，温度高于60℃后，酶基本不具备活力，表现出明显的低温蛋白酶特性；在0℃-30℃内酶活力稳定，50℃、60℃和70℃处理10min后，蛋白酶的活性仅为原活性的70％、42％和7％，25℃保温30min后仍保持100％的活性，符合低温蛋白酶对热敏感的特性；

2)最适pH为9-10，属于碱性蛋白酶；

3)该酶受丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF抑制，金属蛋白酶抑制剂EDTA以及半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64对蛋白酶活性无影响，表明该蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶；

4)金属离子Ni²⁺、Zn²⁺、Hg²⁺、Cu²⁺、Fe³⁺、Ca²⁺、和Mg²⁺可部分抑制酶的活性，而DTT和巯基乙醇等还原剂及Triton X-100和吐温-80等表面活性剂对酶活性无显著影响。

4.一种如权利要求2或3所述的碱性低温蛋白酶的生产方法，其特征在于包括以下步骤：

a、菌株活化；菌株活化包括菌株复壮和菌株筛选，菌株复壮是将碱性低温蛋白酶海洋菌株接种于适合其生长的复壮培养基表面，10-15℃培养3-5天，菌株筛选是将经复壮的菌株接种至筛选培养基表面，10-15℃培养3-5天，菌落周围产生明显的透明圈，挑取透明圈与菌落直径比最大的菌株作为后续发酵用菌株；

b、发酵；将菌株直接接种于发酵培养基中发酵，或者是将菌株先进行液体增殖培养，再接种于发酵培养基中发酵；发酵的条件为：接种量5-15％，发酵温度为5-30℃，pH为6-10，转速为150-200转/分钟，发酵周期为72-120小时；

c、收集碱性低温蛋白酶；从发酵所得培养液中收集碱性低温蛋白酶即得成品。

5.根据权利要求4所述的生产方法，其特征在于所述发酵温度为10-15℃，所述发酵步骤中的pH为9-10。

6.根据权利要求4或5所述的生产方法，其特征在于所述复壮培养基为2216培养基，所述筛选培养基为含有1wt％脱脂奶粉的2216培养基；所述2216培养基的成分以重量计为：蛋白胨0.5％，酵母膏0.1％，NaCl 11.738％，KCl 0.332％，KBr 0.048％，MgCl₂·6H₂O 5.305％，SrCl₂·6H₂O 0.020％，CaCl₂·2H₂O 0.7345％，Na₂SO₄ 1.9585％，NaHCO₃ 0.096％，H₃BO₃ 0.013％，(NH₄)₂SO₄ 0.5％，去离子水，pH9.0。

7.根据权利要求4或5所述的生产方法，其特征在于所述发酵培养基中的碳源为柠檬酸钠，用量为发酵培养基总量的0.5-1wt％。

8.根据权利要求4或5所述的生产方法，其特征在于所述发酵培养基中的氮源为酪蛋白，用量为发酵培养基总量的0.5-1wt％。

9.根据权利要求4或5所述的生产方法，其特征在于所述发酵培养基中的产酶促进剂为吐温-80，用量为发酵培养基总量的0.05-0.1wt％。

10.根据权利要求4或5所述的生产方法，其特征在于所述发酵培养基中的重量组成为：酪蛋白0.5％，柠檬酸钠0.5％，蛋白胨0.5％，酵母膏0.1％，NaCl 11.738％，KCl0.332％，KBr 0.048％，MgCl₂·6H₂O 5.305％，SrCl₂·6H2O 0.020％，CaCl₂·2H₂O 0.7345％，Na₂SO₄ 1.9585％，NaHCO₃ 0.096％，H₃BO₃ 0.013％，(NH₄)₂SO₄ 0.5％，Tween-80 0.05％，去离子水，pH9.0。