[发明专利]一种碱性低温蛋白酶海洋菌株、低温碱性蛋白酶及其生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物及微生物发酵领域，具体涉及一种细菌产生的、具有低最佳酶反应温度的蛋白酶、产生该酶的微生物菌种及其生产该酶的方法。

背景技术

蛋白酶是目前应用最多的一种酶，占全球酶工业市场份额的60～65％。目前使用的蛋白酶基本上都是中温酶。与中温蛋白酶相比，低温蛋白酶在低温下(＜10℃)能保持活性，K_cat值和生理效率(K_cat/K_m)高，有着更高的催化活性等特征，因此低温蛋白酶比中温蛋白酶更具应用价值。低温蛋白酶应用于食品、洗涤剂、化妆品、水产饲料等工业上，有着中温蛋白酶无法取代的优越性。来源于微生物的低温蛋白酶用于洗涤行业已有一些报道，例如丹麦NOVO公司的Savinase 4.oT碱性低温蛋白酶。国内，公开号为CN1109750C的专利提供了一种碱性低温蛋白酶、制造方法、应用和产生该蛋白酶的微生物，涉及一种新的黄杆菌属未知菌株YS9412-130，由该菌株或其突变体产生的新型碱性低温蛋白酶；公开号为CN1611596A的专利提供了一种低温蛋白及其生产方法，涉及一种假单胞菌C15-3CGMCC No.1021，一种碱性低温蛋白酶及其制备方法，涉及一种细菌和从细菌得到的蛋白酶。公开号为CN1670187A的专利提供了一种从南极深海泥样获得并经分离成为纯培养物的菌株海杆菌属R2、从R2菌株得到的碱性低温蛋白酶及其制备方法。但总的而言，国内外目前菌种之间的差异性较大，存在所产生菌的酶特性差异，包括最适作用条件、热稳定性、对底物的水解特性等。在现有的研究水平下，可供研究的菌种及其产生的酶十分稀少。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种可生产碱性低温蛋白酶的海洋菌株。

本发明的目的之二在于提供一种较抵的温度下具有较高的酶学活性的碱性低温蛋白酶。

本发明的目的之三在于提供一种利用可生产碱性低温蛋白酶的海洋菌株生产碱性低温蛋白酶的方法。

本发明可生产碱性低温蛋白酶的海洋菌株，其为交替假单胞菌(Pseudoalteromonassp.)B8453013，2009年9月14日保存于中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.：3281。该菌株通过对来源于加拿大海盆的海水样本进行微生物菌种的培养、分离与筛选，获得一批嗜(适)冷菌株，并从中筛选获得一株低温蛋白酶高产菌株，标号为B8453013，从而提供了一种低温蛋白酶产生菌株，其具有产低温蛋白酶的优良特性，经16SrRNA鉴定，属于假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)。B8453013细胞呈短杆状(0.4μm×2～3μm)，单个排列，单端生鞭毛。革兰氏染色为阴性。该菌株在2216培养基表面，菌落圆形、低突起、有光泽、乳白色、不透明。在酪蛋白培养平皿上可产生明显的透明圈。该菌种产生的低温蛋白酶最适反应温度为25℃，最适pH为9-10。

本发明的微生物菌种，可产生碱性低温蛋白酶，生产该蛋白酶的DNA的核苷酸序列如序列<400>1所述，且与B8453013的16S rDNA的同源性为100％的同源性。该菌株可由保藏的菌种分离，或从海洋环境中培养、筛选。另外，该菌种可通过自然及人工的诱导变异的菌株，只要产生下述蛋白酶特性的菌株皆在此范围。

本发明所涉及的产生低温蛋白酶的微生物菌种，其在分类学意义上属于假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)，本发明菌种从加拿大海盆海水样本中分离获得。

本发明涉及的低温蛋白酶菌株，其16S rDNA序列如序列<400>1所述。

本发明低温蛋白酶的产生菌种，可以是自然筛选的原始菌株，或通过自然变异或人工诱导变异的变异菌株。

作为上述变异菌株的研制方法，包括物理诱变异，如紫外线辐射处理、钴60辐射处理、粒子注入处理、激光辐照等各种射线处理；化学诱变，如亚硝基胍、硫酸二乙酯等化学诱变处理，用常规蛋白酶产生菌分离筛选培养基及方法筛选出生产性能优量的菌株。

另外，也可通过分子生物学技术，从原始菌株或诱导变异菌中获取低温蛋白酶基因，将基因转入受体菌，构建基因工程生产菌株，也可产生作为本发明的低温蛋白酶产生菌种。

作为本发明的低温蛋白酶产生菌种B8453013，可采用如下方法对其进行保存、复壮与筛选，及摇瓶发酵获得本发明的碱性低温蛋白酶。