[发明专利]一种检测哈维氏弧菌的试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种检测哈维氏弧菌的试剂盒，其试剂包括以下三组试剂：

第一组试剂为用于配制等温扩增反应液的试剂，该组试剂包括Thernopol反应缓冲液、dNTP溶液、MgSO₄溶液、上游内引物(Vh-FIP)、下游内引物(Vh-BIP)、上游外引物(Vh-F3)、下游外引物(Vh-B3)、甜菜碱溶液及无菌双蒸水；

所述Thernopol反应缓冲液的组成成分为pH8.8的Tris-HCl溶液、(NH₄)₂SO₄、KCl、MgSO₄及Triton X-100；

所述上游内引物(Vh-FIP)为TTCGCTTTCGCGAGCCATCTGGTTACCAATTGATCGCCCG；

所述下游内引物(Vh-BIP)为ACGCAGAATCAAGCAGTGTGCTCCGATTTATTCGCCACGACA；

所述上游外引物(Vh-F3)为CAAAACGGTTCCGAAACGC；

所述下游外引物(Vh-B3)为：TCGATTCCCCAAGTTTGGAG；

并且，该组试剂中的各试剂的量及浓度足以配制出各成分具有如下工作浓度的等温扩增反应液：

第二组试剂为Bst DNA聚合酶；

第三组试剂为显色剂。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述第一组试剂中各试剂的浓度如下：

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述等温扩增反应液每管23μL的组成体系如下：

4.根据权利要求1或2或3所述的试剂盒，其特征在于所述Bst DNA聚合酶的浓度为每微升8个活性单位，即浓度为8U/μL。

5.根据权利要求1或2或3所述的试剂盒，其特征在于所述显色剂为10wt％荧光染料SYBR GREEN I。

6.一种使用权利要求1～5中任一权利要求所述试剂盒检测水产动物哈维氏弧菌的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)弧菌DNA的提取

A.挑取28℃培养16-24小时的单菌落，置于含有0.1-0.5ml无菌水的离心管中，充分悬浮菌体；

B.95-100℃沸水浴10-15分钟后取出，冰浴2-5分钟；

C.用台式离心机10000-120000转/分钟离心5-10分钟，收集上清液至一个新的1.5mL离心管中，即为待检摸板DNA；

(2)哈维氏弧菌的环介导等温扩增

a.配制等温扩增反应液；

b.在装有23μL等温扩增反应液的反应管中加入1μL待检摸板DNA，于电热恒温水浴槽中95℃放置3-5分钟，立即置于冰上1-3分钟；

c.在反应管中加入1μL Bst DNA聚合酶；

d.于电热恒温水浴槽浴中60-65℃放置30-90分钟；

e.将电热恒温水浴调到80-95℃终止反应，3-5分钟后取出；

(3)显色检测

在反应管中加入1μL显色剂，直接用肉眼观察颜色变化，根据颜色变化情况判断样品是否为哈维氏弧菌。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于所述23μL等温扩增反应液的组成为：

8.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于所述Bst DNA聚合酶的浓度为每微升8个活性单位，即浓度为8U/μL。

9.根据权利要求6或7或8所述的检测方法，其特征在于所述显色剂为10wt％荧光染料SYBR GREEN I，在所述显色检测中，如果颜色为黄色，说明待检测细菌不是哈维氏弧菌，如颜色变为绿色，则说明样品为哈维氏弧菌。