[发明专利]一种检测哈维氏弧菌的试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种采用环介导等温扩增技术快速检测水产动物哈维氏弧菌的试剂盒，以及用该试剂盒检测哈维氏弧菌的方法。

背景技术

哈维氏弧菌是一种广泛分布于海洋环境中的革兰氏阴性嗜盐菌。哈维氏弧菌是最近十多年才被认识到的水产养殖动物的重要致病菌。它既是印尼、泰国、印度、澳大利亚、厄瓜多尔及中国(包括台湾)等国家和地区养殖对虾和贝类的重要致病菌，又是许多养殖鱼类的病原，给海水养殖业造成了巨大的经济损失。

灵敏、快速、特异的病原检测技术对哈维氏弧菌引起的水产动物疾病的防控有重要意义。目前用于哈维氏弧菌检测的方法包括病原分离以及分子生物学方法。基于细菌分离培养的最大可能数法(Most probable number，MPN)虽然被广泛采用，但该方法费时(4-6天)；核酸探针杂交技术虽然特异、灵敏，但步骤繁琐；聚合酶联式反应(polymerase chain reaction，PCR)和实时荧光定量PCR(real-time PCR)技术虽然灵敏、快速，但是两种方法要求实验室有PCR仪器或荧光定量PCR设备，且对操作人员素质要求高，且PCR扩增后需通过电泳步骤获得结果也是一个繁杂的问题。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplication，LAMP)是一种新型的核酸扩增技术。扩增反应在在恒温下进行(60-65℃)，是一种特异、高效、快速的扩增DNA的技术。由于LAMP的扩增效率非常高，扩增反应结果可以通过荧光染料染色后肉眼观察；扩增反应可产生大量的焦磷酸镁而使反应呈现浑浊，在LAMP扩增结束后无须电泳可直接肉眼观察反应是否有浑浊现象来判断是否有扩增，且不需要昂贵的PCR仪，可广泛应用于病原的基层检测。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种采用环介导等温扩增技术快速检测水产动物哈维氏弧菌的试剂盒。

本发明的目的之二在于提供一种使用该试剂盒检测哈维氏弧菌的方法。

本发明检测水产动物哈维氏弧菌的试剂盒，其试剂包括以下三组试剂：

第一组试剂为用于配制等温扩增反应液的试剂，该组试剂包括Themopol反应缓冲液、dNTP溶液、MgSO₄溶液、上游内引物(Vh-FIP)、下游内引物(Vh-BIP)、上游外引物(Vh-F3)、下游外引物(Vh-B3)、甜菜碱溶液及无菌双蒸水；

所述Themopol反应缓冲液的组成成分为pH8.8的Tris-HCl溶液、(NH₄)₂SO₄、KCl、MgSO₄及Triton X-100；

所述上游内引物(Vh-FIP)为TTCGCTTTCGCGAGCCATCTGGTTACCAATTGATCGCCCG，如序列<400>3所示；

所述下游内引物(Vh-BIP)为ACGCAGAATCAAGCAGTGTGCTCCGATTTATTCGCCACGACA，如序列<400>4所示；

所述上游外引物(Vh-F3)为CAAAACGGTTCCGAAACGC，如序列<400>1所示；

所述下游外引物(Vh-B3)为：TCGATTCCCCAAGTTTGGAG，如序列<400>2所示；

并且，该组试剂中的各试剂的量及浓度足以配制出各成分具有如下工作浓度的等温扩增反应液：

第二组试剂为Bst DNA聚合酶；

第三组试剂为显色剂。

优选地，所述第一组试剂中各试剂的浓度如下：

实际使用中，所述等温扩增反应液每管23μL的组成体系优选如下：

所述Bst DNA聚合酶的浓度为每微升8个活性单位，即浓度为8U/μL。

所述显色剂为10wt％荧光染料SYBR GREEN I。

本发明使用上述试剂盒检测水产动物哈维氏弧菌的方法，其包括如下步骤：

(1)弧菌DNA的提取

A.挑取28℃培养16-24小时的单菌落，置于含有0.1-0.5ml无菌水的离心管中，充分悬浮菌体；

B.95-100℃沸水浴10-15分钟后取出，冰浴2-5分钟；

C.用台式离心机10000-120000转/分钟离心5-10分钟，收集上清液至一个新的1.5mL离心管中，即为待检摸板DNA；

(2)哈维氏弧菌的环介导等温扩增