[发明专利]一种由苏云金杆菌发酵液制备活性毒素的方法

说明书

【技术领域】

本发明涉及微生物农药苏云金杆菌发酵液后处理技术领域，特别是一种将苏云金杆菌发酵液中的伴胞晶体和芽胞沉淀不经洗涤直接碱解制备活性毒素的方法。

【背景技术】

苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）是一种产生伴胞晶体、能寄生于昆虫体内引起昆虫发病的芽胞杆菌。自20世纪中期实现工业化生产以来，已成为当前世界上产量最大、应用最广的一种生物杀虫剂，广泛用于防治农业、林业、贮藏害虫以及医学昆虫。苏云金杆菌的工业生产主要采用深层液体发酵法，菌种在发酵罐内经过30-36 h的搅拌培养产生大量的伴胞晶体和芽胞，发酵液经过离心或超滤浓缩后制备液体制剂，或喷雾干燥后制备粉剂。

苏云金杆菌制剂中的伴胞晶体是主要杀虫成分，但伴胞晶体本身没有毒性，它是由原毒素为基本单元组成的二聚体结构。伴胞晶体被昆虫取食后，在肠道碱性环境下溶解释放出原毒素蛋白（分子量约130 kDa），原毒素蛋白在酶的作用下发生降解，最终得到分子量为65-70 kDa 活性毒素蛋白。这种活性毒素蛋白是一种稳定片段，它可以特异性地结合于昆虫中肠细胞的糖蛋白受体上，在细胞膜上产生一个直径1-2纳米的孔。这个孔洞导致中肠上皮细胞膨胀并瓦解，引起昆虫死亡。为了研究苏云金杆菌的杀虫效果和毒素蛋白结构，科研人员经常需要提取这种活性毒素。根据文献报道（宋萍 , 潘映红 , 陆秀君，等. 两种纯化苏云金杆菌HD-73 毒素蛋白方法的比较研究[J]. 河北农业大学学报, 2005,28(3): 63-65；周艳琴，姚宝安，夏雪山，等. Bt 伴胞晶体毒素对小鼠体内不同时期日本血吸虫的作用[J]. 华中农业大学学报, 2005,24(5): 492-494），苏云金杆菌活性毒素的提取要经过以下几个步骤：

（1）发酵液制备。采用摇瓶或发酵罐制备苏云金杆菌发酵液。

（2）胞晶混合物的制备。苏云金杆菌发酵液经离心沉淀、去除上清液后获得芽胞和伴胞晶体混合物。

（3）胞晶混合物的洗涤。采用0.5-1 mol/L氯化钠溶液和无菌水依次洗涤，去除对伴胞晶体有降解作用的蛋白酶类。

（4）原毒素的制备。胞晶混合物采用碱液处理，伴胞晶体在溶解过程释放出原毒素。离心分离沉淀，原毒素溶液进行等电点沉淀。

（5）活性毒素的制备。原毒素采用蛋白酶降解，获得活性毒素溶液。活性毒素溶液经过透析、等电点沉淀、离心、洗涤、冻干等步骤得到活性毒素粉末，或经过凝胶层析过滤柱纯化，冷冻干燥制备活性毒素干粉。

有些国内外文献提供的操作程序更为复杂，它们首先对发酵液中的伴胞晶体与芽胞进行分离，然后对纯净的伴胞晶体进行碱溶、酶解获得活性毒素溶液（田野. 苏云金芽孢杆菌Cry1Ac毒素对棉铃虫作用机理的研究[D]，长沙：湖南师范大学. 2008年12月）。在伴胞晶体与芽胞分离过程中，发酵液的固形物含量不能过高，因此处理量较小。

上述方法提取活性毒素操作步骤多，提取量较小。研究表明，伴胞晶体的降解是从C端开始的，最后得到一段分子量65000-70000的N端片段。这个片段对蛋白酶的水解具有很强的稳定性，普通蛋白酶不能将其继续降解。基于此点考虑，预先对胞晶混合物进行氯化钠洗涤和进行胞晶分离是不必要的，而且提取液中保留足够数量的蛋白酶反而有利于活性毒素的生成。本发明简化了活性毒素的提取程序，将苏云金杆菌发酵液离心去除上清液后，直接碱溶，经过离心、超滤、等电点沉淀、冷冻干燥得到活性毒素粉末。这种提取方法操作简便，提取量大。

【发明内容】   

本发明的目的在于改进现有的苏云金杆菌杀虫毒素提取的方法，通过简化原毒素蛋白的制备程序，直接将伴胞晶体降解成对蛋白酶稳定的活性毒素片段。这种活性毒素不仅比原毒素耐贮藏，而且能够完整保持杀虫活性。

本发明公开了这种苏云金杆菌活性毒素的提取方法，其特征在于按照下列步骤操作：

（1）将苏云金芽胞杆菌发酵液装入离心管，高速离心去除上清液，得到胞晶混合物沉淀物。

（2）将步骤1所得的胞晶混合物沉淀物，用去离子水调配成固形物含量的重量与体积比为5%-15%的悬浮液，在搅拌下水浴升温，在30-60℃条件下滴加1mol/L NaOH溶液，维持溶解体系的pH在10—12之间，碱解4—5 h，得到伴胞晶体的碱溶解液； 或者：