[发明专利]口蹄疫杂交瘤细胞株、单克隆抗体、检测试剂和试剂盒

说明书

技术领域

本发明系有关于一种生产抗口蹄疫病毒之单克隆抗体的杂交瘤细胞、其单克隆抗体，及包含此单克隆抗体的免疫检测试剂和试剂盒，特别是关于一种可用于夹心酶连接免疫吸附试验之生产抗口蹄疫病毒非结构蛋白之单克隆抗体的杂交瘤细胞株、其单克隆抗体，以及包含此单克隆抗体的免疫检测试剂和试剂盒。

背景技术

口蹄疫(FMD；foot-and-mouth diease)为偶蹄类动物之高度传染性疾病，主要感染的经济动物如牛，猪和绵羊。口蹄疫常以发烧与嘴、舌头、鼻孔、脚和乳头的上皮水泡及腐烂等症状为特征。口蹄疫病毒是一个正股RNA病毒，隶属于Picornaviridae科之Aphthovirus属，为小的无封套病毒，含有8.5kbp基因可转译出结构与非结构蛋白(NSPs)。本病毒含有7种血清型，包括O、A、C、Asia 1、SAT 1、SAT 2和SAT 3等分布在全世界，而每个血清型无交叉保护作用，FMDV在各个血清型之间由于具有高的突变速率因此演化的过程也是即为快速，其中于病毒的表面如VP1结构蛋白为主要的中和部位是极具有可塑性(Plasticity)及高抗原性变异。在1997年，台湾爆发严重的口蹄疫疫情，由血清型O型病毒引起的(命名为O/TAW/97)。此株为非典型的嗜感染猪原型。经试验研究发现该株之非结构蛋白区3A之一段(即93-102)密码子缺损，此片段为决定病毒是否能于试管内牛上皮细胞增殖之主要限制生长因素，故此缺损片段之病毒株证实是造成O/YUN/TAW/97病毒株在牛只体内毒力减弱的原因。在1997年爆发当时，由于控制和贸易限制等而造成国家经济受到严重的影响(估计总值超过60亿美元)。另一病毒株，在金门发现自亚临床感染的动物，病毒基因含有全长的3A非结构蛋白转译区，证实为牛型之强毒株(O/TAW/2/99)。O/TAW/2/99口蹄疫病毒为南亚血清O型的地理型(Topotype)，自1999年入侵台湾。当时疾病爆发后，立即采取检疫措施，且在感染牧场中进行筛除，并尽快销毁处置感染的畜体。而预防性筛检疑似感染牧场也同时列入防堵措施。

若以传统不活化病毒生产方法之缺点为：(1)由于口蹄疫为高度传染性疾病，藉由空气传染，制备不活化病毒需使用到病毒，不仅实验室必须符合生物安全等级之三级负压实验室，而且实验过程中病毒有可能发生再活化，危险性高。(2)不活化病毒无法产生寄主于活体感染状态下自然产生的非结构蛋白，因此检测效能欠佳。

发明内容

本案系利用大肠杆菌细胞(E.coli.)来表达口蹄疫病毒之非结构蛋白(Non-Structural Protein，NSP)，利用亲代细胞与骨髓瘤细胞融合而制成杂交瘤细胞株。将O/TWA/99病毒株之3ABC基因应用pRSET、pET 32、pET43及pBlueBacHis2等载体系统进行克隆，再应用大肠杆菌及杆状病毒进行蛋白质之表达，以纯化后之NSP作为抗原进行酶结合免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay；ELISA)。特征在于能够专一性辨识动物感染口蹄疫病毒后所产生的NSP抗体，本案所保护之技术标的，包含针对FMDV NSP的杂交瘤细胞株及其单克隆抗体，以及包含有该单克隆抗体之Sandwich ELISA检测试剂或其试剂盒等。

而本案因应安全性及有效性考虑，不使用病毒而系利用分子生物学技术，以非结构重组蛋白的抗原决定位开发杂交瘤来生产单克隆抗体，此法不需用到病毒，可在二级实验室进行，安全性高，而且该方法可以检测NSP抗体，以正确分辨出活体感染口蹄疫病毒之个体。且经实验发现，其敏感性及特异性皆高于95％以上，显示本案发明对于感染口蹄疫病毒之检体有专一性，并可区别自然感染及疫苗免疫动物产生之抗体。

本发明系提供一种杂交瘤细胞，系由亲代细胞与骨髓瘤细胞融合而制成，其特征如保藏号为PTA-11304之细胞株所示，亲代细胞系由原核细胞所表达之口蹄疫病毒之由3ABC基因片段所编码之NSP作为抗原免疫至小鼠，并将小鼠体内之脾脏细胞取出而制成，且杂交瘤细胞株所生产之单克隆抗体能够专一性辨识口蹄疫病毒之3ABC肽片段，且不会与猪水疱病(Swine vesicular disease；SVD)抗血清产生非特异性反应。

因此，本发明之主要目的为提供一种杂交瘤细胞株，由于其所生产之单克隆抗体对口蹄疫病毒之NSP具有专一性辨识能力，且不会与其它水疱性疾病抗体产生交叉反应，故可用于发展免疫快速检测试剂之用途。