[发明专利]一种以多环芳烃为底物的降解菌的筛选方法

权利要求书

1.一种以多环芳烃为底物的降解菌的筛选方法，其特征在于：

1）富集培养，采用逐步提高多环芳烃浓度的方法对以多环芳烃为底物的降解菌进行富集培养；

2）分筛培养：取步骤1）中富集培养液稀释10¹-10⁷后，涂布于山梨醇固体培养基中，置于28-32℃恒温培养箱中培养1-3周，挑取具有降解圈的单菌落分别点种于含多环芳烃的牛肉膏蛋白胨培养基中，置于28-32℃恒温培养箱中培养1-2周；

3）成膜法快速筛选降解菌：将步骤2)中生长的菌株点种于带有多环芳烃膜的无机盐固体培养基上，置于28-32℃恒温培养箱中培养1-3周，能够生长的菌株即为能够以多环芳烃为唯一碳源的降解菌株。

2.按权利要求1所述的以多环芳烃为底物的降解菌的筛选方法，其特征在于：所述步骤1）富集培养：将菌样接种于含多环芳烃的液体无机盐培养基中进行转接培养，每次转接培养条件为置于28-32℃恒温摇床上180r·min^-1培养30天,共转接4-5次, 转接量按体积百分比计每次培养液10%接种于含多环芳烃逐渐增加的50ml液体无机盐培养基中,待用；其中含多环芳烃的液体无机盐培养基中多环芳烃首次加入量100㎎·L^-1，而后以每次增加100㎎·L^-1的速度逐渐增加。

3.按权利要求1或2所述的以多环芳烃为底物的降解菌的筛选方法，其特征在于：所述多环芳烃是首先溶于丙酮的，按质量体积比(g·ml^-1)为1:1000将多环芳烃溶于丙酮中，制成1000㎎·L^-1的母液。

4.按权利要求1所述的以多环芳烃为底物的降解菌的筛选方法，其特征在于：所述含多环芳烃的牛肉膏蛋白胨培养基中的多环芳烃是溶于二甲基亚砜的，按质量体积比(g·ml^-1)为1:500将多环芳烃溶于二甲基亚砜中，制成2000㎎·L^-1的母液。

5.按权利要求1所述的以多环芳烃为底物的降解菌的筛选方法，其特征在于：所述山梨醇固体培养基为：每升山梨醇无机盐培养基中加入1ml维生素母液。

6.按权利要求5所述的以多环芳烃为底物的降解菌的筛选方法，其特征在于：所述山梨醇无机盐培养基为每升液体无机盐培养基中加入9g山梨醇，0.5g酵母粉和按培养基总重的2％的琼脂条；所述维生素母液配方为：对氨基苯甲酸 200mg，生物素 200mg，叶酸 200mg，烟酸200mg，泛酸钙 100mg，维生素B6 100mg，核黄素 100mg，硫胺素 100mg，维生素B12  1mg，用无菌水定容至1000ml，用0.4μm滤膜过滤除菌。