[发明专利]一种以多环芳烃为底物的降解菌的筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及污染土壤生物修复技术领域，具体的说是一种以多环芳烃为底物的降解菌的筛选方法。

背景技术

多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)是指一类由2个或2个以上苯环以线状、角状或成簇形式构成的独特的持久性有机污染物。很多PAHs会在生物体内积累通过细胞毒性、遗传毒性和免疫毒性对生物体产生致癌、致畸、致突变作用，对自然界生物安全和人类健康构成巨大威胁．美国环保局在20世纪80年代已将16种不带分支的PAHs列入优先污染物名单中，我国也把PAHs列入环境污染物的黑名单中。因此，对PAHs污染土壤进行修复是一项十分迫切的任务。

微生物降解多环芳烃具有环保高效廉价的特点，被公认为是去除环境中多环芳烃的重要途径之一，通过从土著微生物群落中筛选高效PAHs降解菌株并接种回原位污染土壤中，达到修复污染土壤的目的。其中，高效降解菌的筛选是进行有效生物修复的技术关键。

传统PAHs降解功能菌的筛选往往带有一定的盲目性和随机性，工作量大，费时费力，且成本高。开发一种快速，高效的筛选方法迫在眉睫，类似的研究方法也为其他功能微生物资源的开发提供借鉴。

发明内容

本发明目的在于提供一种以多环芳烃为底物的降解菌的筛选方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种以多环芳烃为底物的降解菌的筛选方法：

1）富集培养，采用逐步提高多环芳烃浓度的方法对以多环芳烃为底物的降解菌进行富集培养；

2）分筛培养：取步骤1）中富集培养液稀释10¹-10⁷后，涂布于山梨醇固体培养基中，置于28-32℃恒温培养箱中培养1-3周，挑取具有降解圈的单菌落分别点种于含多环芳烃的牛肉膏蛋白胨培养基中，置于28-32℃恒温培养箱中培养1-2周；

3）成膜法快速筛选降解菌：将步骤2)中生长的菌株点种于带有多环芳烃膜的无机盐固体培养基上，置于28-32℃恒温培养箱中培养1-3周，能够生长的菌株即为能够以多环芳烃为唯一碳源的降解菌株。

所述步骤1）富集培养：将菌样接种于含多环芳烃的液体无机盐培养基中进行转接培养，每次转接培养条件为置于28-32℃恒温摇床上180r·min^-1培养30天,共转接4-5次, 转接量按体积百分比计每次培养液10%接种于含多环芳烃逐渐增加的50ml液体无机盐培养基中,待用；其中含多环芳烃的液体无机盐培养基中多环芳烃首次加入量100㎎·L^-1，而后以每次增加100㎎·L^-1的速度逐渐增加。

所述多环芳烃是首先溶于丙酮的，按质量体积比(g·ml^-1)为1:1000将多环芳烃溶于丙酮中，制成1000㎎·L^-1的母液。

所述含多环芳烃的牛肉膏蛋白胨培养基中的多环芳烃是溶于二甲基亚砜的，按质量体积比(g·ml^-1)为1:500将多环芳烃溶于二甲基亚砜中，制成2000㎎·L^-1的母液。

所述山梨醇固体培养基为：每升山梨醇无机盐培养基中加入1ml维生素母液。所述山梨醇无机盐培养基为每升液体无机盐培养基中加入9g山梨醇，0.5g酵母粉和按培养基总重的2％的琼脂条；所述维生素母液配方为：对氨基苯甲酸 200mg，生物素 200mg，叶酸 200mg，烟酸200mg，泛酸钙 100mg，维生素B6 100mg，核黄素 100mg，硫胺素 100mg，维生素B12  1mg，用无菌水定容至1000ml，用0.4μm滤膜过滤除菌。