[发明专利]一种溶藻减负复合生物制剂的制备方法

权利要求书

1.一种溶藻减负复合生物菌剂的制备方法，其步骤是：

A、Ⅰ、Ⅱ级菌种培养：

 (1)培养基：

① 溶藻菌培养基：

牛肉膏1-5g 、  蛋白胨8-12g 、 氯化钠 3-7g 、 水1000ml、 琼脂1.5-2.5% 、  pH=7.0-7.8；

  ② 减负复合菌剂培养基：

 红糖 80-120g 、 磷酸氢二钾0.01-0.05g、硫酸镁和0.01-0.03g 、 水1000ml 、 pH=6.8-7.4；

(2)Ⅰ级种子培养：

① 无菌室消毒：接种应在无菌室内的超净工作台上进行，接种前将无菌室内和超净工作台内的紫外灯同时打开，灭菌；

 ② 接种：试管、平板和三角瓶接种应在超净工作台内进行；

  ③ 培养：菌种接种后应放在培养架上或生物培养箱内培养，温度控制在25-29℃；

(3) Ⅱ级种子培养：

   ① 无菌室消毒：同Ⅰ级种子培养中的第一步①；

② 接种：试管、平板和三角瓶接种应在超净工作台内进行,操作人员必须穿戴消毒过的工作服和工作帽，接种前手用体积分数75%的酒精消毒后再开始操作，接种针或环必须在酒精灯上烧红3次，进行接种，将试管斜面或在培养皿平板培养好的Ⅰ级菌种，用接种针和接种环，将菌种转接到三角瓶液体中，操作时接种物在酒精灯的火焰边进行，接种完毕后立即用棉塞将试管封口或立即盖上三角瓶；

③ 培养：a、溶藻菌Ⅱ级菌种接种后应放在恒温摇床上振动培养，温度控制在25-29℃，每天摇动2-3次；B、减负复合菌剂Ⅱ级菌种接种后室温静置培养；

④ Ⅱ级菌种培养5-7天后，进行Ⅲ级种子培养；

B、 Ⅲ级种子：

(1)、 溶藻菌Ⅲ级种子：

①培养基配制：先用40-60℃的温水将牛肉膏、蛋白胨分别溶化，加井水，然后加入氯化钠，其中按每升分别将牛肉膏、蛋白胨、氯化钠的比列在混合器中搅拌均匀，再分别装入25L的清洗干净的塑料壶中；

② 接种：待本步骤第一步①培养基融化后，冷却到29-31℃，再加入250-350mLⅡ级溶藻菌菌种，然后把接种好的菌水塑料壶用棉塞或牛皮纸包扎；

③发酵：在壶口插上通气和出气管各一支，在28-32℃条件下通气发酵培养，5-7天后发酵完成，生产种子；

(2)、 减负复合菌剂Ⅲ级种子：

① 培养基配制：先烧开10000ml的水，温度在90-100℃，加1000g的红糖，把红糖融化开，把红糖里面的有害菌消除，然后分别加入0.01-0.03g硫酸镁和0.01-0.05g磷酸氢二钾；

② 接种：待本步骤第一步①培养基融化后，冷却到29-31℃，然后接种1000gⅡ级减负复合菌剂菌种；

③ 发酵：后把10000g的菌水整体装进容器中，密封发酵，6-8天后，打开瓶口，闻到酸甜发酵成功；

C、规模化生产方法：

(1)培养基：

① 溶藻菌培养基：

牛肉膏1000-2000g   蛋白胨4000-6000g  氯化钠 3000-7000g  水1m³   pH=7.5；

  ② 减负复合菌剂培养基：

红糖400000-60000g 、 磷酸氢二钾1000-5000g 、  硫酸镁1000-3000g  、 水10m³ ；  

(2) 溶藻菌规模化发酵生产：

     先用40～60℃的温水，将牛肉膏、蛋白胨分别溶化，然后加入氯化钠，其中牛肉膏、蛋白胨和氯化钠以每方分别1000-2000g、4000-6000g、3000-7000g在混合器中搅拌均匀，再放入1-10m³的培养池中，加溶藻菌Ⅲ级种子0.1-1m³，然后加井水至1-10m³，最后用塑料薄膜密封，28-32℃发酵培养；

(3) 减负复合菌剂规模化发酵生产：

先用开水，温度控制在90-100℃，将红糖溶化，加井水500L,然后按每10 m³加入红糖，硫酸镁和磷酸氢二钾 的量,在混合器中搅拌均匀，再放入10-20m³的培养池中，加溶藻减负复合菌1-2m³，然后加井水至10-20m³，最后用塑料薄膜密封，28-32℃发酵培养；

(4) 溶藻减负复合生物制剂配比与包装：

   1）将发酵生产好的溶藻菌和减负复合菌按照3：7的比例混合；

2） 产品用50L-1m³塑料桶包装；

3）抽样对产品按照企业标准进行检查，检查合格后贴上检验合格证。