[发明专利]一种表达β-半乳糖苷酶的重组菌株及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种表达β-半乳糖苷酶的重组菌株及其构建方法和应用，属于生物技术领域。

背景技术

β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)学名为β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶(以下简称半乳糖苷酶)，常用名为乳糖酶，该酶能将乳糖水解成为半乳糖与葡萄糖。

半乳糖苷酶最早用于乳制品产业，由于牛奶在西方人的饮食结构中占有很大比重，所以国外对半乳糖苷酶的研究较早，许多研究工作主要集中在低乳糖奶加工和乳糖不耐症(Lactose Intolerance)的诊断治疗上。乳糖是哺乳动物乳汁中特有的糖类，哺乳动物乳汁中乳糖含量因种类而异，人乳中乳糖含量为6.7％.，牛乳中乳糖平均含量为4.5-5％。尽管牛乳及其乳制品具有“近乎完美的食物”的美誉，但在我国，乳制品的发展仍处于初级阶段，其中乳糖不耐症是限制其发展的主要原因之一。由于乳糖需经过由小肠粘膜上皮细胞分泌的半乳糖苷酶水解成半乳糖和葡萄糖后才能被人体吸收利用，所以乳糖不耐症的病因主要是由于小肠粘膜上半乳糖苷酶活力较低所致。牛乳中乳糖得不到水解，小肠内乳糖浓度提高，使渗透压增高，从而导致进入肠腔内的水分含量提高，其产生的症状是腹部压力增高、气胀、腹痛和腹泻。绝大多数哺乳动物出生之后小肠粘膜乳糖酶活性较高，可以消化吸收来自母乳或其他乳制品的乳糖，断乳之后，乳糖酶活性随年龄增长逐渐下降，到成人之后半乳糖苷酶活性仅为正常婴儿水平的5-10％，并逐渐发展成为乳糖不耐症。据统计乳糖不耐症影响着全世界约70％的人(尤其是亚洲和非洲人)对乳的摄入。

生产低乳糖奶，是目前克服乳糖不耐症的最好方法。经典方法是将新鲜牛乳经巴氏灭菌后，冷却至40-45℃，加入半乳糖苷酶并保温，使乳糖水解。研究发现当乳糖水解率为70-80％时，既能解决乳糖不耐症问题，又能生产出风味良好的产品。低乳糖奶的生产国外早已商业化，国内则刚起步。低乳糖奶的生产方式有多种，上述只是其中多生产方法中的一种。从理论上讲，低乳糖奶生产方法有物理去除法、化学酸水解法、酶水解法和基因工程技术方法。其中酶水解法由于反应条件温和，产物简单，不破坏牛乳中其他营养成分，生成的副反应产物较少，而且口感较好，得到了广泛的推广。迄今为止，酶水解法是生产低乳糖牛乳最安全、实用、有效的方法。酶水解法生产低乳糖奶的过程中，酶的添加有2种方式。一种是将原料乳经过巴氏杀菌后冷却至半乳糖苷酶作用的最佳温度，添加酶并在此温度下保温一段时间，使其达到所要求的乳糖水解度，然后将产品进行灭菌，进行无菌灌装。这种方法操作简单，产品不容易受到污染，但灭菌处理时发生的美拉德反应(食物中的还原糖与胺类物质在高温下产生黑褐色物质的一种反应)容易引起产品的褐变，从而影响产品的感官质量，而且耗时较长。另一种方法是将原料乳灭菌、冷却后，在产品灌装前按一定比例将半乳糖苷酶加入到产品中，在贮存过程中，半乳糖苷酶将牛乳中的乳糖分解为葡萄糖和半乳糖。这种方法所需设备投资低，产品的色泽变化不大，但是添加酶时，灭菌后的牛乳容易受到微生物的污染，而且酶的作用时间较难控制，酶反应后可能需要额外的杀菌步骤，例如UHT或UV等。

Thermus thermophilus HB27是一种研究十分广泛的嗜热菌种，其中的基因资源十分丰富。由于它的生存环境温度高，营养贫乏，造成其代谢途径中的酶系的性质及其特殊。目前为止，已经有许多来自Thermus thermophilus HB27的基因被克隆并在不同的表达系统中表达出来，包括许多糖苷水解酶，例如淀粉酶和葡萄糖苷酶等。这些酶的耐热性都很高，最适温度在60-95度之间。目前还没有任何来自Thermus thermophilus HB27的β-半乳糖苷酶基因被克隆并表达的报道，且此酶的蛋白质序列与其它物种差异较大，即使是与同一亚种的Thermus thermophilus A4菌种的同源性也不大于30％。利用Thermusthermophilus HB27的β-半乳糖苷酶的耐高温的性质，可以建立适用于乳制品巴氏消毒法工艺。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种表达β-半乳糖苷酶的重组菌株，该菌株所表达的耐高温β-半乳糖苷酶适用于乳制品巴氏消毒法。

本发明还要解决的技术问题是提供上述重组菌株的构建方法。

本发明最后要解决的技术问题是提供上述重组菌株在生产耐高温β-半乳糖苷酶中的应用。

一种表达β-半乳糖苷酶的重组菌株，该菌株为基因组DNA上整合了来源于嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)HB27的β-半乳糖苷酶基因bgal的毕赤酵母。