[发明专利]检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的免疫胶乳微球及其制备方法

说明书

 

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的免疫胶乳微球及其制备方法。

背景技术

蛋白酶抑制剂广泛存在于植物体内，尤其在植物的贮藏器官内含量相当高。在植物体内蛋白酶抑制剂的生物学功能主要有两个方面：①通过与内源蛋白酶相互作用，调控组织细胞内的有关生理生化过程；②防止细胞、组织内的蛋白质成分被外源蛋白酶所降解。其更重要的作用在于作为一种抵御外界植食性昆虫和微生物攻击的化学防卫因子。研究证实，大多数植物来源的蛋白酶抑制剂对植物内源性蛋白酶没有抑制作用，但对外源蛋白酶有特异的抑制活性，这就为通过基因工程提高农作物防卫系统的效能提供了自然进化上的基础。

豇豆胰蛋白酶抑制剂（cowpea trypsin inhibitor，CpTI）属丝氨酸蛋白酶抑制剂。与Bt毒蛋白相比，其杀虫机理完全不同且具有杀虫广谱，对人畜安全，昆虫不易产生抗性的优点而受到人们的重视。通过转基因技术将CpTI基因导入作物而获得的转基因植株已在我国部分地区得到了大规模的应用，但迄今对于转基因植物中豇豆胰蛋白酶抑制剂的检测方法不多，且检测灵敏度、检测限和抗干扰能力等亟待提高。目前，有关CpTI抑制剂免疫检测技术的研究报告和相关专利技术国内外报道很少，迫切需要开发高效、准确、快速的新型免疫检测技术和产品。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的免疫胶乳微球及其制备方法，进一步填补CpTI抑制剂免疫检测技术的研发空白；取材简单、操作方便；制备方法细致严谨，重复性高；所制备的免疫胶乳微球颗粒小，粒径均匀，能检测CpTI融合蛋白最低限0.2μg/ml，其相关系数R²=0.67。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现：

一种检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的免疫胶乳微球，免疫微球由抗CpTI蛋白多克隆抗体包被，微球颗粒大小为200nm，最低检测限为CpTI融合蛋白0.2μg/ml，相关系数R²=0.67。

一种检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的免疫胶乳微球的制备方法，包括以下步骤：

1）设计全长CpTI基因序列，根据原核细胞表达的优先密码子重新修饰并采用全基因合成技术构建全长CpTI基因表达序列；

2）将步骤1）得到的CpTI基因片段通过限制酶切割插入谷胱甘肽-S-转移酶（GST）基因融合表达载体中，构建细菌融合表达载体；

3）通过步骤2）对表达载体进行细菌表达后，利用亲合层析柱纯化获得GST-CpTI融合蛋白；

4）将经过步骤3）得到的GST-CpTI融合蛋白抗原溶合弗氏佐剂后免疫小鼠，经分离纯化得到鼠抗CpTI多克隆抗体；

5）将经过步骤4）得到的鼠抗CpTI多克隆抗体通过羧基-氨基化学偶联法偶联活化微球，得到检测CpTI蛋白的免疫胶乳微球。

在上述所述的检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的免疫胶乳微球的制备方法中，在步骤2）中的谷胱甘肽-S-转移酶（GST）基因融合表达载体是pGEX-4T-2，构建完成后的融合表达载体是pGEX-4T-2-CpTI。

在上述所述的检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的免疫胶乳微球的制备方法中，在步骤3）中的亲合层析柱为谷胱甘肽琼脂糖凝胶（Glutathione Sepharose）4B。

在上述所述的检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的免疫胶乳微球的制备方法中，在步骤5）中采用单分散羧基化聚苯乙烯微球为基质材料，羧基化聚苯乙烯微球大小200nm，表面载基团为羧基，羧基化聚苯乙烯的分子式如下：

  该微球的活化是首先用活化剂EDC（碳化二亚胺）活化微球，然后加入保护剂N-羟基硫代琥珀酰亚胺（Sulfo-NHS）使微球形成稳定的活泼酯中间体，以备连接抗体分子之用。

本发明的有益效果为：采用单分散羧基化聚苯乙烯微球为基质材料，用化学偶联方法偶联抗CpTI多克隆抗体获得，取材简单、操作方便；制备方法细致严谨，重复性高；所制备的免疫胶乳微球颗粒小，粒径均匀，能检测CpTI融合蛋白最低限0.2 μg/ml，其相关系数R²=0.67。

附图说明

下面根据附图对本发明作进一步详细说明。

图1是本发明实施例所述的羧基化聚苯乙烯微球的扫描电镜图；

图2是本发明实施例所述的检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的免疫胶乳微球的制备方法中CpTI基因的原序列全长图谱；