[发明专利]用一粒稻谷鉴定籼稻和粳稻的分子标记方法

权利要求书

1.一种用一粒稻米提取DNA样本的方法，其特征在具体步骤如下：

（1）取一粒稻米，研磨成粉末，加入750μL CTAB 提取缓冲液；

（2）缓冲液经氯仿/异戊醇萃取后，在7000~13000转/分钟条件下离心；

（3）上清液中加入等体积沉淀缓冲液，于-20℃放置30分钟，按步骤（2）离心；

（4）沉淀物中加入500μL纯化液，重复步骤（2）；

（5）上清液加入无水乙醇，-20℃沉淀DNA，按步骤（2）离心，沉淀物经70%乙醇漂洗、离心后烘干。

2.一种用于鉴定籼稻和粳稻的InDel特异性引物对，其特征在于PCR产物长度差异为24-67bp的寡聚核苷酸及其衍生物序列，共40对，列表如下：

编号引物对名称正向引物DNA序列(5'-3')反向引物DNA序列(5'-3')1R1M7ATTCCTGGTTCTACATTACTTACGCCTCACTAGAATATCGGA2R1M30AAGGGGCCCTAATTTATCTATGTTTACTTTGTTCTTGGACTG3R1M37ATAGTTCGCCATCGTCATACACGCCATAGCAAGGAA4R1M47AATAGAATTACTGATGAAACCTTAGCCCGTTACCGCTTATGT5R2M10CCCAGTCTGCTGCCATCTGAATGTATTTCAGTTCCAGTAAG6R2M24GGGCAACAACGGCTCTGAGGGAATAAGGCGATACGG7R2M26GCAGCAAAGTGCGGAGTACAGGTGAATTGCCAATTT8R2M50CCTGAAGGAAATGATAGCAATAGGTTTTGTATGCTCTTCACTTGTC9R3M10CCGAGTACCATTGCTTTCCTGCCATAGTTACTGCTCTGTT10R3M23TGCTTACAAGGGTCCAATGGAGGTGCCTACCAAGAG11R3M30AGGCTAAGTGAAGAAATAATAAGCTCCGTATTCATTACTGGTTG12R3M53ACACTGGCTACGGCAAAGTTTGTTCGGGAATAATGATGC13R4M13TACACGGTAGACATCCAACAATGATTTAACCGTAGATTGG14R4M17AGTGCTCGGTTTTGTTTTCGTCAGATATAATTGATGGATGTA15R4M43CTTGAACCTGAGTGAGTGGCGATGAAAATGATGTCTA16R5M13GAGAAAGAGTGGAAGGAGAGTATCGTCAGGAGGGTC17R5M30CTCAATTTCACCCATCCCCGCTCCGTCTCCAACCTC18R5M40TTCTGCCGCTATCCTGCTATGCCCTTGCTATTATCGTTGT19R6M14AAATGTCCATGTGTTTGCTTCCATGTGTGGAATGTGGTTG20R6M44TTAGGAATAAAGGCTGGATATTACCGTTAATAGGTGGAA21R7M7ACCTTCCCTCCCCTTTTGAT AACTTGGTCTTCCTGTTTTATTG22R7M24GGCACGGGCTATAAAGTGAGGGAAGATACGGTTGGT23R7M30ATTGTTATGCTCGCTCTTACGAGTGCTGACTGATTACGG24R7M37CAGCCCTAAATCTAAATACCCACGTTGAGACAGGCGAGC25R8M23CCTATTCACTCTACCGACATGTTTAGTTCCCATTGCTTT26R8M32ATCGGACTGTTTCTCACCCAACACTAACCTCGCTCA27R8M33CGAAAGAGGAGAGGGGTAGTCGAAAACGAGAAACAAATA28R8M46CAGCAGAGTCCAGAGAAGATGCATAAGATGGCGAGTGA29R9M10CTTTGGATTCAGGGGGAAACTTGAAACGGAGGCAG30R9M14ATGGCATTCAATCCAGAAAGAGACGGTCAACGAGCA31R9M42CTATAAGACCAAAACGAAAACTGAAAACCATTGTGTCACTGTA32R10M17TGAACAATAAACCACAGAAGCACCCTTTATTCCCTCCTTTG33R10M30CCCTAAAAATAGAGCAACCTACCCATAATACTACCAATCAAC34R10M40GTCCCTAGGCCATCTCTTGGCGAATAGGGGTGGACAG35R11M23AAGGTTGACAAGGACAGAAGTCGCAGGAATGGATAAAA36R11M40AAGAAAAATATCTATTGAGGAGTGGGAGGACCATAAATGACGG37R12M10ATCATTTCAGCCTGTGCCAGCTTAATAGGGGGGACG38R12M16GGAACCAGGCTATCCACTGAAGCTGCTCGATCACAA39R12M27ATTTCATTGCCATCAGTTGTAATCTTCTATCCGTTCA40R12M43CCGCCGAGAAGAAACAAACCCAAGAACAGGATTACA

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3.一种利用InDel分子标记鉴定籼稻和粳稻的方法，其特征在于具体步骤如下：

（1）按照权利要求书1所述，从一粒稻谷或稻米中提取DNA样品；

（2）采用如权利要求书2所述的40对特异引物，对提取的水稻DNA样品进行PCR扩增；

（3）利用琼脂糖电泳方法检测PCR产物；

（4）计算基因频率：

根据PCR产物的电泳结果和读取记录电泳结果中样品在各特异位点上的基因型结果，使用下述公式来计算样本各特异位点的平均籼稻型基因频率F_i或粳稻型基因频率F_j，其变化在0-100%之间：

籼稻型基因频率（%）                                                                    

 粳稻型基因频率（%）                            

 式中：

X_ii为样本某一特异位点的纯合籼稻基因型；

X_jj为样本某一特异位点的纯合粳稻基因型；

X_ij为样本某一特异位点的籼-粳稻杂合基因型；

N为使用引物对的数目，取6—40；

（5）籼稻和粳稻的确定

根据检测的一粒稻谷DNA样品中各特异位点的平均基因频率F_i或F_j，确定水稻样品为不同类型的籼稻或粳稻，具体判断标准如下：

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