[发明专利]用一粒稻谷鉴定籼稻和粳稻的分子标记方法

说明书

技术领域

本发明属于生物类型鉴别技术领域，具体涉及一种在一粒水稻种子（或稻米）中提取DNA，并鉴定其籼稻和粳稻特性的方法。

技术背景

栽培稻（Oryza sativa L.）是我国重要的三大粮食作物之一，在我国的农业生产和经济发展中占有举足轻重地位。栽培稻起源于我国，已有8000多年的栽培历史，目前广泛种植于全球。在栽培稻的栽培和驯化过程中，由于适应不同的生态环境，产生了显著的籼稻和粳稻遗传分化。典型的籼稻和典型的粳稻之间已经形成了明显的生殖隔离，故通常将籼稻和粳稻分成两个亚种：籼稻亚种（Oryza sativa subsp. indica）和粳稻亚种（Oryza sativa subsp. japonica）。籼稻和粳稻不仅在形态、生理和生化性状方面产生了较大的差异，而且也形成了不同的稻米品质和口感品味等特点。稻米的不同消费人群对于籼稻或粳稻的喜好是不同的，如北方人更偏重选择粳稻，这就造成了不同类型稻米在价格上有较大差异。同时在育种中，由于籼稻和粳稻的遗传分化以及上述特征特性，进行籼稻和粳稻的亚种间有性杂交，可以产生丰富的遗传变异类型而培育出优异的水稻品种；籼稻和粳稻的亚种间杂种优势，在杂交稻的培育中也具有重要的价值。因此，对于籼稻和粳稻的鉴定，不仅可以确定特定稻米的商品价值，而且在水稻育种中也具有重要的实践意义。

虽然籼稻和粳稻的准确鉴定极为重要，但是一直以来，对籼稻和粳稻的准确鉴定都存在较大的问题。传统鉴定籼、粳稻的方法主要依赖于形态性状变异(如：株高，株型等)以及生理生化功能差异。目前用来鉴定籼稻和粳稻最常用的方法是以形态鉴定为基础的“程氏指数法”，（包括6个性状：稃毛、酚反应、穗节长、稻壳色、叶毛和谷粒长宽比）。这个方法的最大缺点：1）由于形态性状受环境的影响较大而导致检测的不准确；2）形态测量必须要栽种被测水稻样品，从播种到成熟一般需要3-5个月，耗时长；3）形态测量需要一定的样品群体，故需要较多的水稻样品；大大影响了籼稻和粳稻鉴定的效率。专利“利用水稻DNA插入或缺失分子标记鉴定籼稻和粳稻的方法”大大提高了籼稻和粳稻鉴定的准确性和效率。但是，水稻DNA的提取通常是以新鲜叶片来进行，需要将稻种进行萌发，形成幼苗，1周甚至10天以后才能提取DNA，耗时较长。对于不能萌发出苗的种子，无法提取DNA。以一粒稻米中提取的DNA为模板，结合InDel分子标记方法，能更快速和高效地确定稻米样品的籼、粳特性。

发明内容

本发明的目的是提供一种仅用一粒稻谷（或稻米）提取DNA，并利用InDel分子标记电泳和分析，快速和精确鉴定稻谷样品籼稻和粳稻特性的方法。

本发明提出的一粒稻谷鉴定水稻的籼稻和粳稻特性方法，是一种利用一粒稻谷（或稻米）中提取的微量DNA为模板、插入或缺失（InDel）分子标记以及琼脂糖电泳技术鉴定水稻品种的方法。具体来说是以一粒稻谷中提取的DNA为模板，利用水稻亚种间DNA序列的特异性差异InDel片段，设计扩增引物组合以及衍生物，对籼稻型等位基因（I）和粳稻性等位基因（J）的频率（F_i或F_j）进行计算，并根据这些频率的值（0-100%）来确定籼稻和粳稻的方法。

本发明用于提取一粒稻米中微量DNA样本的方法，具体步骤如下：

（1）取一粒稻米，研磨成粉末，加入750μL CTAB 提取缓冲液；

（2）缓冲液经氯仿/异戊醇萃取后，在7000~13000转/分钟条件下离心；

（3）上清液中加入等体积沉淀缓冲液，于-20℃放置30分钟，按步骤（2）离心；所述缓冲液配方可选为：0.5~1.5% CTAB，40~60 mmol/L Tris-HCl pH7.8~8.5，9.5~10.5 mmol/L EDTA  pH7.8~8.5；

（4）沉淀物中加入500μL纯化液，重复步骤（2）；所述纯化液配方可选为：9.5~10.5 mmol/L Tris-HCl  pH7.8~8.5，0.8~1.2 mmol/L EDTA  pH7.8~8.5，0.8-1.2 mol/L NaCl；

（5）上清液加入无水乙醇，-20℃沉淀DNA，按步骤（2）离心，沉淀物经70%乙醇漂洗、离心后烘干。 

本发明用于鉴定籼稻和粳稻的InDel 特异引物一共有40对，具体如下表1：