[发明专利]台勾霉素的生物合成基因簇及其应用

说明书

技术领域：

本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及抗生素台勾霉素的生物合成基因簇的克隆、分析、功能研究及其应用。

背景技术：

近年来，抗生素的滥用导致了各种耐药菌的出现，直接威胁人类的生命和健康。艰难梭菌(Clostridium difficile)就是其中的一种。艰难梭菌引起的腹泻(Clostridium difficile-associateddiarrhoea，CDAD)已经成为困挠人类健康的一个严重的问题(Johnson，2007)，另外，部分抗生素腹泻(antibiotic-associated diarrhea，AAD)和大部分抗生素性结膜炎(antibiotic associatedcolitis，AAC)也是由艰难梭菌引起的(Gerber & Ackermann，2008；Y-K·舒；C-K·王；Y-H·邱；A·罗梅罗；F·巴巴卡尼；P·西尔斯；F·奥库姆，2005)。这些疾病成为卫生保健体系的主要经济负担，据保守估计，美国医院每年都为此花费30-60亿美元(Kyne et al.，2002；Y-K·舒；C-K·王；Y-H·邱；A·罗梅罗；F·巴巴卡尼；P·西尔斯；F·奥库姆，2005)。大环内酯类抗生素台勾霉素(tiacumicins，又称lipiarmycins)，具有抗各种细菌病原体的活性，特别是针对艰难梭菌有明显的抗菌活性(Ackermann et al.，2004；Karlowsky et al.，2008)。台勾霉素是一系列18元环大环内酯类抗生素的总称，由放线菌指孢囊菌Dactylosporangium aurantiacum subsp.hamdenensis NRRL 18085，游动放线菌Actinoplanes deccanensis ATCC 21983和小孢链菌Catellatospora sp.Bp3323-81等产生(Coronelli et al.，1975；Hochlowski et al.，1987；Kurabachew et al.，2008)。研究发现台勾霉素中台勾霉素B(Tiacumicin B)是最好的活性组分，其拥有两个脱氧糖基和一个芳香环支链，C-18为R-羟基(见图1)，对艰难梭菌具有较低的最小抑制浓度(MIC)值，体外对艰难梭菌的抗菌活性为万古霉素的8-10倍(Y-K·舒；C-K·王；Y-H·邱；A·罗梅罗；F·巴巴卡尼；P·西尔斯；F·奥库姆，2005)。目前该药物已经进入到三期临床试验阶段(Louie et al.，2009；Shue et al.，2008)。最近有报道表明，台勾霉素B也具有很好的抗结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)活性(Kurabachew et al.，2008)和体外抗癌活性(Wu et al.，2009)。因此，这种针对革兰氏阳性细菌的高效新型抗生素具有很大的潜力开发成新药(Gerber & Ackermann，2008)。

近年来蓬勃发展起来的组合生物合成技术，为改造台勾霉素的生产菌指孢囊菌NRRL18085带来了新的机遇。在阐明了自然界的生物合成途径、理解自然界聚酮化合物天然组合生物合成机理的基础上，人们可以采用组合生物合成技术对抗生素的生物合成基因、调控基因进行体内敲除、突变、置换和重组等操作，不但能够生产“非天然”的天然产物结构类似物，而且还可以提高天然产物的产量，或定向积累所需要的天然产物，为天然产物的发现和药物开发提供分子和活性多样性。

发明内容：

本发明的第一个目的在于提供一种台勾霉素的生物合成基因簇。

本发明的台勾霉素的生物合成基因簇，其特征在于，该生物合成基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，包含31个基因，具体为：

1)聚酮合成酶基因，即tiaA1、tiaA2、tiaA3、tiaA4共4个基因：

tiaA1位于基因簇核苷酸序列第41491-57180个碱基处，长度为15690个碱基对，编码聚酮合成酶，5229个氨基酸；

tiaA2位于基因簇核苷酸序列第57186-66803个碱基处，长度为9618个碱基对，编码聚酮合成酶，3205个氨基酸；

tiaA3位于基因簇核苷酸序列第66829-71337个碱基处，长度为4509个碱基对，编码聚酮合成酶，1502个氨基酸；

tiaA4位于基因簇核苷酸序列第71361-81746个碱基处，长度为10386个碱基对，编码聚酮合成酶，3461个氨基酸；