[发明专利]微生物细胞催化异黄腐酚合成8-异戊烯基柚皮素的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程和微生物发酵领域，具体涉及一种微生物细胞催化异黄腐酚合成8-异戊烯基柚皮素的方法。

背景技术

8-异戊烯基柚皮素(8-Prenylnaringenin，简称8PN)是啤酒花中发现的一种具有雌激素作用的异戊烯基黄酮，文献报道8PN是迄今为止发现的最具潜力的植物雌性激素。体内外研究表明8PN具有较强的雌激素作用，在低剂量下就能发挥功效，较已发现的大豆异黄酮、金雀异黄素等植物雌激素的作用都要强，可有效减缓妇女绝经期的各种症状，而且副作用弱，被认为是取代激素代替治疗法(Hormone Replacement Therapy，HRT)的一种新型植物雌性激素。除了雌激素作用外，8-异戊烯基柚皮素还具有预防癌症、防止骨质疏松、抑制血管增生、抗氧化等其他功效。

8-异戊烯基柚皮素在实际生产中来源主要有两类，一类是直接提取法，另一类是化学合成法。酒花是8-异戊烯基柚皮素的主要来源，因此，早期8-异戊烯基柚皮素的制备大多采用从酒花中直接提取的方法获得。然而，8-异戊烯基柚皮素在酒花中的含量极低，据文献报道1kg酒花中仅含10-100mg。用直接提取法原料消耗量大，成本高，所得到的8-异戊烯基柚皮素杂质含量比较高，且不易除去，无法满足商业需要。目前以异黄腐酚或柚皮素为底物，经过化学合成方法制备的8-异戊烯基柚皮素较多地应用于生产实践。化学合成法制备8PN效果较好，但存在操作复杂、污染大、安全性低、需要保护基团、专一性较差等缺点，这限制了其在实际中的应用。

生物转化是利用植物离体细胞或器官、动物细胞、微生物及其细胞器，以及游离酶对外源性化合物进行结构修饰的生化反应。微生物作为一个完整个体，其体积虽小，但也具有一套自身特异性的酶体系。同时由于微生物资源丰富，种类繁多，对于特异的底物，可供筛选的菌株很多。以多种不同催化功能的酶系对天然活性成分进行生物转化，可产生新的组合性的天然化合物库，再通过活性筛选，可寻找新的高效低毒的天然活性先导化合物，或通过对活性组分中不同成分结构变化与活性强度消长关系的分析发现关键活性成分。利用微生物转化可以发现新一代的先导化合物，已取得了巨大的社会效益和经济效益。生物转化规律还可以指导新药的结构修饰，获得高效长效的新一代药物，足以说明生物转化对新药开发的重要性。

微生物转化是通过微生物整体细胞或酶将复杂的底物进行结构修饰，也就是利用生物代谢过程中产生的某个或某一系列的酶对底物进行催化反应，是近年来新兴起的获得目标产物的又一途径。微生物转化具有许多优点，譬如，微生物倍增时间短，生物量积累快，产生的酶丰富，转化时间短；微生物的基因工程研究工作成熟，转化酶的高效表达成为可能；微生物发酵工艺成熟，便于工业化生产。随着现代提取、分离、鉴定手段的进步，使微生物技术的应用不再局限于传统酿造及小分子化合物的转化，正广泛地应用于药物前体化合物的转化、生物催化不对称合成、光学活性化合物的拆分、新药开发、药物代谢体外模型预测等领域，已成为生物转化技术中发展最为迅速的分支之一。利用微生物对天然产物进行修饰转化获得产物已成为新药开发较为有力的一种手段。

有关8-异戊烯基柚皮素生物法合成的研究甚少，国外仅有利用植物离体细胞合成8-异戊烯基柚皮素的研究，而未见利用微生物进行的生物合成，国内研究则几乎空白。Yamamoto等在研究苦参黄酮G(SFG)合成路径时发现8-异戊烯基柚皮素是合成SFG过程中的一个中间产物。以柚皮素为底物合成SFG的过程中存在着两步异戊烯基化，第一步反应为柚皮素C8位上的异戊烯基化，生成的产物即为8-异戊烯基柚皮素。Sasaki等对苦参细胞中异戊烯基转移酶基因进行了克隆，并将基因导入到酿酒酵母中，构建获得重组酿酒酵母。利用重组酵母对柚皮素进行转化，发现有8-异戊烯基柚皮素的生成，但得率较低。因此，如果筛选获得合适的菌株就能够实现微生物转化合成8-异戊烯基柚皮素，并建立合适的转化体系和方法，再利用发酵便可以获得大量8-异戊烯基柚皮素，这将为进一步做好8-异戊烯基柚皮素的药理研究和临床实验，以及8-异戊烯基柚皮素的工业化生产奠定良好基础，具有重要的理论价值和经济社会效益。

发明内容

本发明提供了一种微生物细胞转化合成8-异戊烯基柚皮素的方法，利用爪哇正青霉将异黄腐酚经生物转化合成8-异戊烯基柚皮素，该方法具有操作简单、转化条件温和，效率高、安全性好、成本低等特点。