[发明专利]一种对氧化损伤高敏感性的面包酵母及其制备方法

权利要求书

1.一种对氧化损伤高敏感性的面包酵母，其特征在于，该高敏感性面包酵母为缺失yap1cwp1cwp2pdr5snq2五个基因的面包酵母。

2.实现权利要求1所述的一种对氧化损伤高敏感性的面包酵母的制备方法，其特征在于，该方法包含下列步骤：

（1）、从野生面包酵母中提取基因组DNA：

1a、取面包酵母，接种于YPD培养液中，在30℃，200转/分钟条件下，振荡培养16小时，得到面包酵母菌液；

其中：YPD培养液配方的重量百分比为：酵母膏1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，余者为水；

1ｂ、取面包酵母菌液1.5毫升，用4000转/分钟离心2分钟，沉淀物悬于200微升提取缓冲液中； 

其中：提取缓冲液的配方为： 曲拉通X-100 2%,十二烷基磺酸钠1%, 氯化钠0.1摩尔,乙二胺四乙酸1毫摩尔, 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐10毫摩尔, 余者为水，pH 8.0；

1c、再加入0.3克酸洗玻璃珠、100微升酚、100微升氯仿，震荡3分钟后，以12000转/分钟离心10分钟，吸取上层液体；

1d、加入所取液体体积2倍的无水乙醇，在-20℃静置30分钟，以12000转/分钟离心15分钟，去上清，取沉淀物；

1e、将沉淀物溶解于20微升无菌水，即为酵母基因组DNA溶液；

（2）、构建yap1Δ:: hisG-URA3-hisG基因敲除组件：

2a、首先利用PCR技术，通过上游引物YAP1-1: GGA TGC GTA AGG TCT TAA GAG和下游引物YAP1-2: CAG TGG TTC TGC AGG TAC GG，将一段2.5Kb的酵母基因组DNA片段扩增出来，其中包含有YAP1的开放阅读框和0.2Kb的上游同源片段和0.35Kb的下游同源片段；

其中：PCR 的条件为：94℃ 5分钟；94℃ 45秒，52℃ 1分钟，72℃ 1分钟，30个循环；72℃ 10分钟；

2b、将上述含有YAP1基因的PCR扩增片段克隆到pGEM-T载体上,用BamHI内切酶和BstEII内切酶切下一段1.8kb的片断，替换上含BamHI内切酶位点的接头；

2c、用BamHI内切酶和BglII内切酶从pNKY51载体上切下一段含有hisG-URA3-hisG的 3.8kb片断，将该片断插入到步骤2b接头中的BamHI位点；

2d、用AflII以及EcoRI内切酶酶切，得到YAP1基因敲除组件：yap1Δ:: hisG-URA3-hisG；

（3）、将基因敲除组件yap1Δ:: hisG-URA3-hisG转入超高通透性面包酵母，筛选得到yap1cwp1cwp2pdr5snq2五基因敲除面包酵母：

3a、将超高通透性面包酵母接种到2毫升YPD培养液，30℃，200转/分钟条件下，振荡培养16小时；

3b、再加入YPD培养液3毫升, 30℃，200转/分钟,培养4小时，得到超高通透性面包酵母菌液；

3c、取1.5毫升超高通透性面包酵母菌液，以2500转/分钟离心2分钟，取沉淀物；

3d、将沉淀物悬于100毫摩/升的400微升醋酸锂中，以2500转/分钟离心2分钟，取沉淀物； 

3e、将沉淀物悬于100毫摩/升的100微升醋酸锂中；

3f、将2.0毫克/毫升的鲑鱼精单链DNA 2微升煮沸5分钟,冰浴后与yap1Δ:: hisG-URA3-hisG基因敲除组件0.1～1微克一起加入到步骤3e的醋酸锂中，室温放置5分钟；

3g、再加入280微升浓度为50%的聚乙二醇4000；

3h、振荡至混匀，30℃静置30分钟；

3i、加入39微升二甲基亚砜，42℃热激5分钟；

3j、4000转/分钟离心2分钟，取沉淀物，并将沉淀物悬于200微升无菌水中；

3k、4000转/分钟离心2分钟，取沉淀物，悬于100微升无菌水中，再悬于非选择性培养基中，生长过夜，然后再涂于5-氟乳清酸选择性培养基平板，30℃培养箱中培养3天，生长出单菌落，即为yap1cwp1cwp2pdr5snq2五基因敲除面包酵母，也就是本发明的一种对氧化损伤高敏感性的面包酵母；

其中5-氟乳清酸选择性培养基平板的制备：将酵母膏1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，琼脂粉2%，余者为水置于121℃高压下灭菌20分钟，待温度降到50℃时，加入5-氟乳清酸 0.1%；

其中非选择性培养基的制备：将酵母膏1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，琼脂粉2%，余者为水置于121℃高压下灭菌20分钟。