[发明专利]一种对氧化损伤高敏感性的面包酵母及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术，尤其涉及经过遗传基因改造的微生物对环境化学污染物的监测。

背景技术

面包酵母是一种简单真核生物，单细胞，遗传改造操作简单，培养简便快速且环境友好，适合作为一种模式生物应用于生命科学研究中。目前在环境污染检测技术领域中，面包酵母作为一种简单真核生物越来越被受到重视，一些以面包酵母为模式生物的检测系统得到了发展。

我们在一种超高通透性的面包酵母（申请号为200910272505.2）的基础上，对酵母氧化损伤响应与修复基因的上游调控基因YAP1进行了敲除，获得了一株不仅可以对大分子量化学物有超高通透性、而且也对氧化损伤化学物高度敏感的酵母突变株。YAP1是一类在氧化应激反应中起重要作用的转录调控因子，是一种b-zip （Basic leucine zipper）蛋白，为转录活化因子AP-1家族中的一员，调控着许多关键抗氧化基因的表达。在氧自由基胁迫下，YAP1蛋白会在细胞核中聚集，调控将近70多种基因的转录，其中包括与维持细胞中氧化还原环境的一系列蛋白，如硫氧还蛋白还原酶 (TRR), 过氧化氢酶 (CTT1),硫氧还蛋白 (TRX2), 超氧化物歧化酶 (SOD1), 细胞色素c氧化酶 (CCP1) 和一系列与谷胱苷肽合成及循环有关基因 (GSH1, GTT1 and GPX2)的表达。因此在YAP1基因缺失后，可有效提高酵母细胞对氧化性损伤的敏感度，同时YAP1作为重要的转录调控因子，在DNA损伤应答中起着关键作用，YAP1基因缺失的面包酵母也表现出了对许多非氧化性DNA损伤的敏感性。因此我们决定在超高通透性酵母的基础上，利用基因敲除技术敲除YAP1基因，建立一种对氧化损伤高敏感性的面包酵母突变株，应用于环境污染中氧化型遗传毒性致癌物的检测。

基因敲除是自80年代末发展起来的一种成熟的分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。由于面包酵母的全基因测序已经完成，所以可以根据目的基因的序列，设计同源基因序列，对目的基因进行敲除。本发明分析了酵母中重要的转录调控因子YAP1的作用，应用基因敲除技术在超高通透性面包酵母（专利申请号为200910272505.2）的基础上，对YAP1基因进行敲除，大大提高了酵母对氧化损伤试剂的敏感性。

发明内容

本发明的目的是，提供一种对氧化损伤高敏感性的面包酵母，该面包酵母是在超高通透性酵母（专利申请号为200910272505.2）的基础上，具有对氧化损伤高敏感性的新菌株，主要用于检测环境中的氧化型遗传毒性致癌物。这种酵母突变株不仅对大分子量化学物有高度通透性、也对化学物的氧化损伤效应有高敏感性，用以提高环境化学污染物的DNA氧化损伤效应的检测灵敏度。本发明的另一个目的是，提供一种对氧化损伤高敏感性面包酵母的制备方法。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

在超高通透性面包酵母（专利申请号为200910272505.2）的基础上，敲除YAP1基因，获得缺失yap1cwp1cwp2pdr5snq2五基因的面包酵母。

一种对氧化损伤高敏感性面包酵母的制备方法为：提取面包酵母基因组DNA，通过特异性引物，以面包酵母基因组DNA为模板，PCR扩增得到YAP1基因，构建得到yap1Δ:: hisG-URA3-hisG敲除组件，并将该组件转入超高通透性面包酵母，发生同源重组，通过筛选得到五基因缺失高敏感性的菌株。由于hisG序列之间的同源重组，URA3基因可被切除，URA3基因可继续做为选择性标记。再将携带URA3基因（尿嘧啶合成酶基因）作为选择性标记的RNR3-LacZ基因融合质粒转入到yap1cwp1cwp2pdr5snq2五基因敲除面包酵母突变株中，得到可用于检测氧化型遗传毒性致癌物的高敏感性面包酵母。