[发明专利]一种对成骨细胞的增殖和功能具有促进作用的药物的生物活性的检测方法

权利要求书

1.一种对成骨细胞的增殖和功能具有促进作用的药物或活性物质的生物活性的检测方法，其特征在于通过检测给予药物后成骨细胞或成骨样细胞中碱性磷酸酶(ALP)的含量，检测成骨细胞的增殖和功能具有促进作用的药物或活性物质的生物活性。

2.权利要求1所述的检测方法，该方法具体包括以下步骤：

(1)复苏冻存细胞株或者进行细胞的原代培养，接种于培养瓶培养增殖；当细胞长满单层后常规消化，以含1-25％小牛血清(胎牛血清、新生牛血清)的培养液调整细胞浓度为(1-9)×10^(3-10)个，置培养箱培养；

(2)培养24小时后，弃培养液，按如下分组加入供试品：①细胞对照组：每孔加含1-25％小牛血清(胎牛血清、新生牛血清)培养液的细胞悬液；②阴性对照组：加含1-25％小牛血清(胎牛血清、新生牛血清)的培养液；③供试药物组：将供试药物以含1-25％小牛血清(胎牛血清、新生牛血清)的培养液配置到合适的检测浓度；

(3)将细胞培养板置37℃、5％CO₂培养箱培养24-336小时后，测定上清液、细胞内或细胞内及上清液的碱性磷酸酶含量；

(4)用酶标仪测定各孔A值：检测波长405nm；对数据进行统计学处理：所有数据以均数士标准差表示，以t检验比较差别的显著性，当P＜0.05时有活性。

3.权利要求2所述的检测方法，还包括步骤(5)根据公式计算刺激指数，用于判断在测药物的活性程度，刺激指数的计算公式如下所示：

或

当刺激指数在1.5-20时认定药物有活性，并且随着刺激指数的增大而判定该药物的活性大小。

4.权利要求2或3的检测方法，其中步骤(3)中细胞培养板的培养时间是72小时。

5.权利要求1-3任一项的检测方法，其中上述对成骨细胞的增殖和功能具有促进作用的药物或活性物质包括对成骨细胞的增殖和功能具有促进作用的天然的或人工合成的生物活性物质、从动物脏器组织中提取制得的生化药品或多组分生化药品以及中药制剂，如动物骨多肽制剂，包括骨肽制剂(注射剂、口服制剂)、鹿瓜多肽制剂(注射剂、口服制剂)、复方骨肽注射剂(注射剂、口服制剂)、骨瓜提取物注射剂(注射剂、口服制剂)等动物骨多肽的各种制剂。

6.权利要求1-3任一项的检测方法，其中成骨细胞或成骨样细胞包括所有动物的成骨细胞原代细胞，及已经建立的成骨或成骨样细胞系，可以包括成骨细胞、软骨骨细胞和所有的类成骨细胞(成骨样细胞)，包括：成骨样细胞株MG-63、成骨样细胞UMR106、人成骨样细胞OS-732、成骨细胞系hFOB1.19(hFOBs)、人成骨细胞系HOS-8603、新生小鼠颅骨成骨细胞、新生大鼠颅骨成骨细胞、胎兔颅骨成骨样细胞、人成骨样细胞MMP、大鼠骨肉瘤成骨样细胞MAPK、人成骨样细胞SAOS-2(SaOS-2细胞)、成骨样细胞株ROS17/2.8、小鼠骨样细胞MLO-Y4、小鼠成骨样细胞MC3T3-E1、永生化大鼠成骨细胞系ROB-1、人成骨样细胞系OS-732、大鼠ROS17/2.8细胞系、成骨样细胞系rob-c20、成骨样细胞(HuO9细胞)等任何一种成骨细胞或成骨样细胞等所有的已经建立的成骨或成骨样细胞系。