[发明专利]一种对成骨细胞的增殖和功能具有促进作用的药物的生物活性的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种药物的生物活性的检测方法，更具体地说是一种对成骨细胞的增殖和功能具有促进作用的药物或活性物质的生物活性检测方法。

背景技术

药物的生物活性检测法是以药物的生物效应为基础，以生物统计为工具，运用特定的实验设计，测定药物有效性的一种方法，从而达到控制药品质量的作用。其测定方法包括生物效价测定法和生物活性限值测定法。

天然的、人工合成的生物活性物质、从动物脏器组织中提取制得的生化药品或多组分生化药品、中药等，由于来源广泛、多变，制备工艺复杂，使得其制剂的质量控制相对困难，又往往因为含有多种活性成分和具有多种药理作用，因此，仅仅控制少数成分不能完全控制其质量和反映临床疗效。为了使此类药物的质量标准能更好地保证每批药品的临床使用安全有效，有必要在现有含量测定的基础上增加生物活性检测，以综合评价其质量。

药物的生物活性检测方法可以运用多种常用的药理学方法进行，其中以动物实验(整体实验)和细胞实验(离体实验)居多并且比较成熟，但是由于骨的生长周期比较长，因此在对具有成骨细胞的增殖和功能具有促进作用的药物或活性物质的生物活性检测时，由于骨生长周期的限制，不适宜用整体实验进行；离体实验，由于组织和器官体外培养的难度很大，所以多选择细胞作为实验载体进行试验。

目前常规的公认的细胞生物活性的化学检测法有三种：①四唑盐(MTT)比色法(原理是：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物，并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的蓝紫色结晶物，用酶联免疫检测仪以在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反应活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比)；②细胞蛋白质含量测定法(考马斯亮蓝测定法，基本原理为：考马斯亮蓝在酸性溶液与蛋白质结合，在595nm波长处呈最大吸收，其OD值与蛋白质含量成正比。主要用于测定蛋白质、受体及细胞外代谢物的特异性活性。)③细胞蛋白质合成测定法(H-亮氨酸掺入法，本原理为：细胞在合成蛋白质时需要摄取外源性氨基酸，用同位素标记氨基酸如H-亮氨酸可以掺入细胞蛋白合成代谢中，通过测定细胞的放射性强度，可了解细胞蛋白质合成代谢情况。)

成骨细胞在骨形成过程中要经历成骨细胞增殖，细胞外基质成熟、细胞外基质矿化和成骨细胞凋亡四个阶段。成骨细胞增殖期成骨细胞数量增加，以形成多层细胞，并合成、分泌 I型胶原以便最终可以矿化形成骨结节。在细胞增殖晚期，与细胞周期与细胞增殖相关的基因表达下降，而编码细胞外基质成熟的蛋白的基因开始表达，在分化早期主要是碱性磷酸酶表达，因此碱性磷酸酶(ALP)被认为是细胞外基质成熟的早期标志，ALPmRNA表达此时可增加10倍以上。成骨细胞分泌ALP和钙盐结晶体至细胞外基质中，ALP使局部磷酸含量增高，促使基质矿化。在细胞外基质成熟期，胶原继续合成并相互交联、成熟。在成骨细胞分化晚期，当培养细胞进入矿化期，细胞内的ALP活性下降，而与细胞外基质中羟磷灰石沉积相关的基因表达达到高峰，如骨桥蛋白(osteopontin)、骨钙素、骨唾液酸白(bonesialoprotein)基因。骨钙素等非胶原蛋白分泌至细胞外基质中，与钙、磷结合，然后，沿胶原分子的长轴，钙和磷结合到胶原分子的侧链的胶原氨基酸残基上，形成羟磷灰石结晶。体外培养的成骨细胞在骨矿化期骨钙素高度增加，此后，骨钙素逐渐降低，与此同时，可观察到胶原酶增加，成骨细胞开始凋亡，并出现代偿性细胞增殖和胶原合成。

常用的比较成熟的三种检测方法均为检测细胞存活和生长情况，由于成骨细胞数量的增加并不能全面反应药物对成骨细胞功能的影响情况，而成骨细胞的功能是反映药物活性的重要指标，因此对于药物所具有的促进成骨细胞的特征性功能(碱性磷酸酶分泌、骨钙素分泌、胶原蛋白合成等特征性功能)的活性来说，上述三种检测方法均存在专属性不强，无法全面反应药物的实际活性的缺点。本发明的目的在于找到一种简单、快速、可操作性强，可用于检测具有促进成骨细胞增殖和功能的药物或活性物质的活性的方法。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种简单、易行、专属性强的用于具有促进成骨细胞的增殖和功能的作用的药物或活性物质的生物活性的检测方法。

本发明方法是通过检测给予药物或活性物质后成骨细胞或成骨样细胞碱性磷酸酶(ALP)的含量，检测成骨细胞的增殖和功能具有促进作用的药物(或活性物质)的生物活性。

具体来说，本发明的方法包括以下步骤：