[发明专利]诱导性多能干细胞的制备方法以及用于制备诱导性多能干细胞的培养基

权利要求书

1.一种诱导性多能干细胞的制备方法，该方法包括以下步骤：

步骤1，将一个或多个干细胞多能性因子导入体细胞；

步骤2，使用添加了锂盐的培养基培养步骤1中导入了干细胞多能性因子的体细胞；以及

步骤3，鉴定诱导性多能干细胞克隆。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，进一步包括将报告基因导入体细胞，以此报告基因来指示所述诱导性多能干细胞的产生及其产生效率。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述报告基因为Oct4-GFP或Nanog-GFP，且优选为Oct4-GFP。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤1中，所述干细胞多能性因子选自Oct4、Sox2、Sox1、Klf4、Klf2、Klf5、Nanog、c-Myc、L-Myc、N-Myc、Lin28和Esrrb中。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，在步骤1中，所述干细胞多能性因子包括Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc，或者包括Oct4、Sox2和Klf4。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤2中，所述锂盐包括氯化锂、碳酸锂、醋酸锂、溴化锂、门东氨酸锂、γ亚麻酸锂、肝素锂、硫酸锂、硝酸锂及其它包含锂离子的化学品。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤2中，所述锂盐为氯化锂。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤2中，所述锂盐的工作浓度为0.1-40mM，且优选为0.5-20mM，更优选为5-10mM，最优选为10mM。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤2中，所述培养基为mES培养基和KSR培养基，所述mES培养基为添加有15％胎牛血清、1000U/mL白血病抑制因子、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、青霉素/链霉素和β-巯基乙醇的DMEM，且所述KSR培养基为添加有15％替代血清、1000U/mL白血病抑制因子、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、青霉素/链霉素和β-巯基乙醇的Knockout DMEM。

10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤2进一步包括：将步骤1中制备的导入了Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四因子或Oct4、Sox2、Klf4三因子的小鼠胚胎成纤维细胞在第二天消化并接种到饲养层细胞中使用mES培养基培养，并在第三天使用添加了锂盐的mES培养基培养，在第六天换为添加锂盐的KSR培养基培养，在第八天换为KSR培养基继续培养；以及挑选具有良好干细胞形态或Oct4-GFP阳性的克隆进行传代。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述体细胞来自哺乳动物的体细胞。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述哺乳动物选自小鼠、大鼠、兔、猪、羊、牛、猴或人。

13.一种用于制备诱导性多能干细胞的培养基，其进一步包含锂盐。

14.根据权利要求13所述的培养基，其中，所述锂盐包括氯化锂、碳酸锂、醋酸锂、溴化锂、门东氨酸锂、γ亚麻酸锂、肝素锂、硫酸锂、硝酸锂及其它包含锂离子的化学品。

15.根据权利要求13所述的培养基，其中，所述锂盐为氯化锂。

16.根据权利要求13所述的培养基，其中，所述锂盐的工作浓度为0.1-40mM，且优选为0.5-20mM，更优选为5-10mM，最优选为10mM。

17.根据权利要求12所述的培养基，其中，所述培养基为添加了锂盐的mES培养基和添加了锂盐的KSR培养基。