[发明专利]诱导性多能干细胞的制备方法以及用于制备诱导性多能干细胞的培养基

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及诱导性多能干细胞的制备方法以及用于制备诱导性多能干细胞的培养基。

背景技术

胚胎干细胞来源于早期胚胎的内细胞团，在体外培养中能够自我更新、保持多能性并具有向三个胚层细胞分化的能力。随着1981年小鼠胚胎干细胞和1998年人的胚胎干细胞的建系成功[1，2]，再生医学的研究真正地拉开了序幕。胚胎干细胞的应用前景主要是用于移植治疗，以胚胎干细胞作为起始细胞，通过体外培养及定向分化，可以为临床治疗提供大量的组织和器官的移植材料。通过对于胚胎干细胞自我更新和定向分化机制的研究，许多特异性的细胞类型(例如，神经细胞、心肌细胞等)已经具备了成熟的分化方法的检测标准，这些研究为帕金森氏病、老年痴呆症、心肌损伤、糖尿病、肝硬化等疾病的治疗带来了希望。然而，胚胎干细胞真正从体外研究到进入临床应用还面临许多技术和伦理问题，比如，如何获得无免疫排斥的胚胎干细胞？如何获得病人自身的胚胎干细胞？等等。

2006年，Yamanaka实验室首先报道可以利用过表达Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四种转录因子使小鼠的成纤维细胞逆分化成具有胚胎干细胞特性的细胞，并将其命名为诱导性多能干细胞(Induced Pluripotent Stem Cells，iPSCells)[3]。在这篇发表在《Cell》杂志上的文章中，研究人员最初是选取了24个与胚胎干细胞信号调控相关的基因作为候选基因，以逆转录病毒为基因转染载体，用混合有多种不同基因的病毒感染小鼠成纤维细胞，最终以细胞形态学特征、胚胎干细胞特定基因的表达以及畸胎瘤的形成等指标作为iPS细胞多能性的鉴定指标。他们在实验中最终将24个候选基因减少到Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc这四个转录因子。虽然在这篇文章中，研究人员最终没有得到嵌合体小鼠，但是直接从已分化的细胞得到干细胞为胚胎干细胞领域甚至生命科学领域都带来了概念性的革新。iPS细胞诱导技术的出现也引起了人们对其生物医学应用的极大关注，因为我们可以病人的体细胞为来源得到病人特异的iPS细胞，这种iPS细胞又可以分化为具有功能的细胞、组织和器官，用于疾病治疗。这样的应用方式可以避免免疫相容性和伦理问题。

2007年，三个不同的实验室均发表文章报道获得了具有种系嵌合能力的小鼠iPS细胞[4-6]。在此之后，也陆续有实验室报道获得了人的iPS细胞[7，8]。2009年，研究人员首次利用iPS细胞通过四倍体囊胚注射得到存活并具有繁殖能力的小鼠，证明了iPS细胞具有真正的全能性[9]。iPS作为诱导产生多能性干细胞的一种技术，在临床疾病治疗方面的应用价值是巨大的，因为它不像传统的核移植或者细胞融合等获取干细胞的方式那样需要人的卵子或人的胚胎干细胞，并且它由成体细胞重编程为干细胞的特性避免了免疫排斥使得自体移植变得更加可行；另一方面，iPS对于干细胞自我更新机制的研究、干细胞信号调控的研究以及很多疾病的研究都有很大意义。

但是，iPS细胞的应用仍然有两大问题，安全问题和诱导效率问题。在生物安全问题方面，最初实验体系中过表达的外源基因中含有两个癌基因(c-Myc和Klf-4)，并且外源基因的导入方式是逆转录病毒，病毒在基因组中有多个拷贝的插入也会导致基因突变及癌变。因此，研究人员正在致力于优化iPS技术使其应用的安全性增加，例如，减少转录因子的数目[10，11]，或者使用非整合到基因组的基因转染方法[12]，还有直接添加透膜的转录因子蛋白的形式进行重编程[13]。但是，这些方法会导致iPS细胞的诱导效率更加低下，目前iPS细胞的形成效率一般都低于1％，这对iPS细胞的发展和应用造成了巨大障碍。因此，寻找能够提高iPS细胞诱导效率的培养条件、方法或小分子化合物，对推动iPS细胞的基础研究和临床应用将有巨大帮助。

发明内容

因此，针对现有技术中存在的问题，本发明人进行了广泛和深入的研究，最终完成本发明。

为了提高iPS细胞的诱导效率，本发明提供了一种诱导性多能干细胞的制备方法，该方法包括以下步骤：

步骤1，将一个或多个干细胞多能性因子导入体细胞；

步骤2，使用添加了锂盐的培养基培养步骤1中导入了干细胞多能性因子的体细胞；以及

步骤3，鉴定诱导性多能干细胞克隆。

优选地，所述方法进一步包括将报告基因导入体细胞以此通过报告基因来指示所述诱导性多能干细胞的产生及其产生效率。且更优选地，所述报告基因为Oct4-GFP或Nanog-GFP，且更优选为Oct4-GFP。