[发明专利]一种抗三聚氰胺单克隆抗体及检测三聚氰胺的试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及抗三聚氰胺单克隆抗体及其应用。

背景技术

三聚氰胺(Melamine)简称三胺，又叫2，4，6-三氨基-1，3，5-三嗪、1，3，5-三嗪-2，4，6-三胺、2，4，6-三氨基脲、蜜胺、三聚氰酰胺或氰脲三酰胺，分子式C₃N₆H₆或C₃N₃(NH₂)₃。三聚氰胺是一种重要的化工原料，广泛运用于木材、塑料、涂料、造纸、纺织、皮革、电气、医药等行业。

三聚氰胺被禁止作为食品和动物饲料添加剂。非法添加三聚氰胺的案例不仅发生在中国，我国曾从马来西亚、泰国、秘鲁、澳大利亚等国家进口的鱼粉、宠物食品中检出三聚氰胺阳性，美国FDA也曾在美国国内生产的饲料中发现含有三聚氰胺。三鹿集团等使用“毒奶”生产的婴幼儿奶粉等奶制品流入全国市场后，导致众多婴幼儿因食用含三聚氰胺的婴幼儿奶粉引发泌尿系统疾患，多名婴幼儿死亡。

目前国内乳品企业大都采用“凯氏定氮法”来检测原料奶的含氮量，以此来估算蛋白质含量。三聚氰胺的含氮量为66.6％，而蛋白质的含氮量一般不超过30％。因此，三聚氰胺常被非法用作添加剂，以提升检测中的蛋白质含量指标。以牛奶蛋白质含量为2.8％计算，含氮量为0.44％；奶粉蛋白质含量为18％计算，含氮量为2.88％。而三聚氰胺含氮量为牛奶的151倍，是奶粉的23倍。每100g牛奶中添加0.1克三聚氰胺，就能提高0.4％蛋白质。

目前检测三聚氰胺的方法为高效液相色谱法(High-performance liquidchromatographic，HPLC)，对仪器设备和人员操作的要求均较高，检测成本高，难以满足对大批量样品检测的需要。

发明内容

本发明的目的是制备抗三聚氰胺单克隆抗体，用于建立快速检测食品中三聚氰胺残留的免疫学方法，所述的方法为竞争法酶联免疫试剂盒与胶体金试纸条。

本发明提供一种产生抗三聚氰胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏号为CGMCC No.4303，分类命名为三聚氰胺特异性淋巴细胞杂交瘤株B-4B5-F10-B11。保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明还提供制备产生抗三聚氰胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株的方法，包括如下步骤：

(1)制备6碳三聚氰胺-载体蛋白藕联物，所述载体蛋白为钥孔嘁血蓝蛋白、牛血清蛋白或卵清蛋白，所述6碳三聚氰胺的结构如下

(2)动物免疫

以步骤1所述6碳三聚氰胺-载体蛋白藕联物为免疫原免疫小鼠，取免疫后小鼠的血清，检测该血清抗三聚氰胺的效价和抑制价，选取效价和抑制价最高的免疫小鼠；

(3)细胞融合

取步骤(2)所得免疫小鼠的脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合、培养；

(4)杂交瘤细胞株的筛选

检测各融合细胞培养后的上清液的抗体效价及抑制价，选取抗体效价及抑制价最高的命名为三聚氰胺特异性淋巴细胞杂交瘤株B-4B5-F10-B11。

本发明还提供所述杂交瘤细胞株分泌的抗三聚氰胺单克隆抗体。

所述抗三聚氰胺单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：

(1)腹水的制备：

将所述杂交瘤细胞株注入baleb/c雌性小鼠腹腔，5-7后天产生腹水；取腹水上清；

(2)抗三聚氰胺单克隆抗体的纯化：

初步纯化：所述腹水上清经饱和硫酸胺沉淀，取沉淀溶解后透析，获得抗三聚氰胺单克隆抗体粗品；

Protein G亲和层析纯化：将抗三聚氰胺单克隆抗体粗品经Protein G亲和层析柱进行纯化，收集吸收峰，即为抗三聚氰胺单克隆抗体。

本发明所述抗三聚氰胺单克隆抗体可以应用于三聚氰胺的定性或定量检测。

本发明还提供一种利用权力要求3所述抗三聚氰胺单克隆抗体检测检测三聚氰胺的试剂盒，该试剂盒的组成如下：

(1)用6碳三聚氰胺-OVA藕联物的碳酸盐缓冲液包被过的酶标板；

(2)HRP标记的抗三聚氰胺单克隆抗体溶液；

(3)TMB显色剂：TMB浓度是0.3g/L；

(4)终止液：浓度为2M的H₂SO₄；

(5)三聚氰胺标准液：浓度分别为0，0.5，1.5，4.5，13.5，40.5μg/L的三聚氰胺标准液。