[发明专利]用于感染性腹泻的检测型基因芯片及检测用试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于基因芯片应用技术领域，涉及一种基因芯片及包含该芯片的检测用试剂盒，尤其是涉及一种引起人类感染性腹泻的主要病原微生物的基因芯片及检测用试剂盒。

背景技术

感染性腹泻是全球发病率高和流行广泛的传染病之一，对人类尤其是儿童健康危害严重，是发展中国家的重要公共卫生问题。据WHO估计，全世界每天约有数千万人发病，每年腹泻病例高达30～50亿例次，有500～1000万病例因严重腹泻而死亡，平均每天死亡2.5万人，儿童所占比例尤其突出，发达国家成人每年发生腹泻至少1～2次，发展中国家的发生率更高。亚、非、拉地区5岁以下儿童每年因腹泻而死亡者约500万以上，年发病数约7.5～10亿人次。WHO报告的1992～2000年调查结果显示腹泻病处于较高的发病水平，特别是5岁以下儿童的发病率达3.2次/人年，尽管死亡率从1954～1979年的13.6‰下降到1992～2000年的4.9‰，每年仍然有250万儿童死亡。在我国，感染性腹泻病的发病率一直位居肠道传染病的首位。2005年全国法定报告的全部传染病中腹泻病例共计1042 181例，占全部传染病的22.49％。2006～2007年我国其它感染性腹泻报告年均发病率为56.69/10万，细菌性痢疾报告年均发病率为30.05/10万。我国于1988年开展21个省(市)腹泻病防治现状的入户调查，根据调查结果推算全国每年约有8.36亿人次发病，其中5岁以下小儿约有2.09亿人次，全国平均发病率0.70次/人年，死亡率约为0.15‰。

根据中国卫生机构统计数据，确定引起人类感染性腹泻的主要病原微生物可能为大肠杆菌(E.coli)/志贺氏菌(Shigella)、沙门氏菌(Salmonella)、霍乱弧菌(Vibriocholerae)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、亲水气单胞菌(Aeromonashydrophila)、邻单胞菌(Plesiomonas)、霍利斯弧菌(Vibrio hollisae)、河流弧菌(Vibrio fluvialis)、拟态弧菌(Vibrio mimicus)、少女鱼弧菌(Vibrio damsela)、弗尼斯弧菌(Vibrio furnissii)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)等。

在微生物检测领域，传统的病原微生物检测技术大都是建立在染色镜检、培养、生化鉴定、免疫血清学试验的基础上的。微生物培养是指利用选择性培养基对目的病原微生物进行分类，以确定其是否存在。这种方法虽然比较准确，但由于细菌的生长繁殖需要较长的时间，不能进行快速诊断；而且，一次培养实验一般只能检测一种或者一类病原微生物，要完成对样品中多个项目的检测是十分繁琐的。

微生物所表现出来的独特的生化性质(如乳糖发酵、降解烷烃等)是由于其细胞内具有相对应的酶而产生的(如能发酵乳糖的细菌具有半乳糖苷酶活性)，因此生化方法检测病原微生物实际上是对微生物细胞内特异性酶的测定，也就是利用不同底物在酶的催化下能产生的不同代谢产物来间接检测该酶的存在，进而实现对该微生物的鉴定和检测。传统的生化方法由于检验项目多、操作复杂、费时等因素影响而使鉴定速度减慢，而且其灵敏性与特异性也受到限制。

免疫血清学方法是利用细菌抗原的独特性及抗原抗体结合的特异性建立起来的现代检测技术，具有特异性强等特点。许多临床疾病已经开始使用这种方法进行病原体检测，如利用HBV表面抗原检测HBV病毒。然而，由于这种方法需要经过至少48小时的细菌培养、扩增和单菌落的分析，并需要对每一个样品的大量单菌落进行抗血清凝聚反应，耗时长且可能出现假阴性。另外，世界上没有一家公司或单位能生产全部细菌的抗血清，即使是最常用的大肠杆菌的抗血清，也只有少数几个公司和单位有全部血清型的抗血清，而国内没有一家单位获得过全套的抗血清。

随着分子生物学和微生物基因组学的迅速发展，越来越多的微生物全基因组核酸序列被公布，人们对病原微生物的认识已经从外部形态结构及生化特性深入到核酸、基因水平。在此基础上，人们建立了许多新的检测技术，如核酸探针(Nuclear acid probe)和聚合酶链反应(Polymerase chain reaction，PCR)等，由于具有灵敏度高、特异性强、操作简便、反应快速等特点，已逐步应用于病原菌的检测。在这样的背景下，生物芯片技术应运而生。