[发明专利]一种鉴定基因抗盐功能的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域中一种鉴定基因抗盐功能的方法。

背景技术

土壤盐渍化是影响农业生产及生态环境的一个全球性问题，盐碱是目前制约我国农业增产的两大土壤因素之一。土壤中的含盐量是影响植物生长的一个重要因子，土壤的盐渍化严重阻碍的植物的生长发育，造成了农作物的减产。目前，全世界大约有20％的农业用地受到盐碱化的威胁，预计到2050年，全世界会有超过50％的土地会变得盐碱化。上世纪四十年代，各国科学家就开始了植物耐盐性研究，特别是近年来，无论是耐盐品种的筛选，还是品种耐盐机理的研究都取得了很大进展。

从目前来看，虽然许多抗性基因被克隆，并通过基因工程在一定程度上提高了转基因植物的抗逆性，但进一步挖掘有潜力的抗逆基因资源仍然是艰巨的任务。这就要求人们把目光投向更广泛的领域中。

要研究一个基因的功能，除了转基因技术以外，最直接有效的办法就是抑制该基因的表达或构建功能性蛋白不能形成的突变体，然后观察其表型的变化。目前已有的用于功能丧失(loss-of-function)研究的方法主要包括化学突变，转座子或农杆菌T-DNA插入突变以及RNAi等。这些方法在拟南芥基因功能研究中非常有效，但在其它植物中尚未能大规模的应用。另外，对引起致死突变或在维持细胞基本功能或发育早期基因的功能进行传统的T-DNA插入与转座子突变体等正向遗传学研究方法具有一定的困难，因为往往这些基因的突变为致死突变。RNAi技术需要转基因操作，实验周期长，载体构建涉及到反向重复结构，细菌操作时容易出错。

病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing，VIGS)是近年来发展的一种快速简单的植物基因功能研究方法。与其它导致基因功能缺失的研究方法如反义抑制、基因突变等相比，病毒诱导的基因沉默具有研究周期短、不需要遗传转化、可在不同的遗传背景下生效以及能在不同的物种间进行基因功能的快速比较等优点，此种技术正在发展成为一种简单、快速、有效、高通量的分析基因功能的方法。病毒诱导的基因沉默是借助一种病毒侵染植物后发生的转录后基因沉默现象，来引起在mRNA水平上发生特异性降解的技术。即如果在病毒载体中插入目标基因片段，侵染寄主植物后，植物会表现出目标基因功能丧失或表达水平下降的表型，从而可以确定基因功能。

VIGS被应用最活跃的领域是植物抗病性相关基因的鉴定和分离。尤其是“基因对基因”抗性相关基因的功能分析方面，近几年来已有较大量文献，而且有逐年增加的趋势。这可能得益于多数基因对基因抗性有一个标志性防卫反应-过敏性反应(HR)。而且不同植物种类间R/Avr下游信号传导途径保守。将互补R/Avr基因对分别克隆入双元表达质粒，转化农杆菌后，导入植物叶片，或将表达Avr的农杆菌或病原细菌本身导入含互补R基因的植物，即可看到R/Avr特异性诱发的HR坏死。比较野生型和VIGS植株的HR坏死产生强度，即可明确被沉默基因在该R/Avr诱发的HR产生中的作用。根据该思路，大量基因在多个R/Avr互作包括Pto/AvrPto，Rx/PVX，Cf/Avr等诱导的HR和抗病性中的作用已得到鉴定。除此之外，VIGS还被用于其它抗病性和防卫反应相关基因的鉴定。研究发现，SGTI和HSP90不仅与多个R基因诱导的HR和抗性相关，而且在非寄主抗性中也起重要作用。另外，VIGS还被应用于抗虫信号传导途径以及植物醇合成途径，光合作用途径，以及纤维素合成途径的分析。目前，与生物逆境中的研究不同，VIGS在非生物逆境的研究方面应用的还很有限，目前还缺乏一种快速鉴定植物里盐胁迫相关基因的方法。

基因LeNHX2是与植物的抗盐性相关的，呈正相关，过表达LeNHX2基因拟南芥的抗盐性提高，而LeNHX2基因表达量下调的番茄对盐更敏感(Rodriguez-Rosales，M.P.，X.Y.Jiang，et al.(2008).″Overexpression of the tomato K+/H+ antiporter LeNHX2confers salt tolerance by improving potassium compartmentalization.″New Phytologist179(2)：366-377)。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测植物中目标基因是否具有抗盐功能的方法。

本发明所提供检测植物中目标基因是否具有抗盐功能的方法，包括如下步骤：