[发明专利]一种H9亚型禽流感病毒检测试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种H9亚型禽流感病毒检测试剂盒及其应用。

背景技术

禽流感是由正黏病毒科流感病毒属的禽类A型流感病毒(Influenza A virus)引起的一类禽类烈性传染病。根据血凝素与神经氨酸酶的抗原性不同，可分为16个H亚型(H1-H16)和9个N亚型(N1-N9)。1966年在美国首次分离到H9亚型禽流感病毒，随后中国大陆、香港、韩国、中东、欧洲以及北美等国家和地区均有报道。中国大陆自1994年首次分离到H9亚型禽流感病毒后，开始广泛流行，对养禽业造成一定的经济损失。

家禽感染H9亚型禽流感病毒，特别当伴有混合感染时，可导致病禽高死亡率及产蛋率严重下降。有文献报道香港曾从患有流感的儿童体内分离出H9N2禽流感病毒。因此，该病不仅对养禽业有较大危害，而且威胁着人类健康。

目前已有多种方法用于H9亚型禽流感病毒的检测，大致可以分为病原学、血清学以及分子生物学三类。病原学方法主要包括组织学诊断、动物接种试验和细胞培养法。血清学方法主要包括琼脂免疫扩散试验(AGID)、血液凝集试验(HA)、血液凝集抑制试验(HI)和酶联免疫吸附试验(ELISA)。分子生物学方法组要包括各种反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、反转录实时PCR(real-time PCR)、核酸恒温扩增法(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)等。上述方法均存在不同的缺点，如操作复杂、费时、设备昂贵等缺点，不适于基层应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种H9亚型禽流感病毒检测试剂盒及其应用。本发明提供的试剂盒基于反转录环介导等温扩增(Reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP)技术，可以快速检测H9亚型禽流感病毒。

本发明提供了检测H9亚型禽流感病毒的专用引物，由以下三对环介导等温扩增所用引物组成；一对引物是与H9亚型禽流感病毒的HA基因(GenBank Accession Number EU644482)结合的内侧引物对，一对引物是与H9亚型禽流感病毒的HA基因(GenBank Accession Number EU644482)结合的外侧引物对，一对引物是与H9亚型禽流感病毒的HA基因(GenBank Accession Number EU644482)结合的环形引物对。

H9亚型禽流感病毒的HA基因的核苷酸序列具体可如序列表的序列1所示(GenBank Accession Number EU644482)。

所述内侧引物对由上游引物FIP和下游引物BIP组成，所述上游引物FIP的核苷酸序列具体可为序列表中的序列4，所述下游引物BIP的核苷酸序列具体可为序列表中的序列5；所述外侧引物对由上游引物F3和下游引物B3组成，所述上游引物F3的核苷酸序列具体可为序列表中的序列2，所述下游引物B3的核苷酸序列具体可为序列表中的序列3；所述环形引物对由上游引物LF和下游引物LB组成，所述上游引物LF的核苷酸序列具体可为序列表中的序列6，所述下游引物LB的核苷酸序列具体可为序列表中的序列7。

应用所述专用引物检测H9亚型禽流感病毒的原理如下：

根据H9亚型禽流感病毒的HA基因设计一组用于反转录环介导等温扩增的引物，即内侧引物对(上游引物FIP和下游引物BIP)、外侧引物对(上游引物F3和下游引物B3)和环形引物对(上游引物LF和下游引物LB)。三对引物和H9亚型禽流感病毒HA基因序列保守区的八个特定区域的序列完全配对(见表1)，可以确保反应的彻底进行，也保证了检测方法的特异性。由于引物识别的8个区域是通过比对最近几年所有H9亚型禽流感病毒的HA基因(包括H9N1至H9N9)寻找出的保守区，所以所述专用引物能特异性的识别所有H9亚型的禽流感病毒。

表1专用引物与H9亚型禽流感病毒的HA基因的结合区域

所述专用引物在AMV反转录酶和具有链置换活性Bst DNA聚合酶的作用下可完成对模板RNA的扩增。扩增过程分为三个阶段，具体如下：

(1)反转录阶段

在AMV反转录酶的作用下，样本RNA被反转录为cDNA。

(2)循环起始阶段