[发明专利]非洲爪蟾白细胞介素8的cDNA及其克隆方法和重组应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物基因工程领域，具体涉及非洲爪蟾白细胞介素8(Xenopus tropicalis IL-8)cDNA及其克隆、表达技术。

背景技术

白细胞介素8（IL-8）是1987年发现的第一个趋化因子，当时被命名为单核细胞衍生的中性粒细胞趋化因子，在炎症中起重要的作用。近年来随着其他具有趋化功能物质的发现，IL-8的生物学活性得到了进一步的确认。在炎性疾病时，炎症灶内存在大量白细胞，IL-8对白细胞具有化学激动和趋化效应，使白细胞游走能力加强，并增进白细胞抗感染免疫应答。而且研究表明IL-8mRNA的表达与疾病发生相伴随，随着疾病的转归而消长。最新的研究表明IL-8通过提高抗凋亡基因BCL-2及MMP-2和MMP-9的表达来调节血管内皮细胞的繁殖和存活从而在血管发生中发挥重要作用。

根据Genebank、EMBL、DDBJ国际三大主要核酸序列数据库的搜索结果得知，到目前为止人、鼠、猪（哺乳类）鸡、鸭、鸽子（鸟禽类）、鲑鱼、河鲶、黑线鱼（鱼类）、中国软壳龟（爬行类）等 的IL-8 cDNA已被克隆，并分别已在GenBank数据库中申请了序列号，而至今模式生物中作为两栖类代表的非洲爪蟾白细胞介素8（XtIL-8）的cDNA还未被克隆出来，关于非洲爪蟾IL-8基因的研究在整个国内外还处于完全空白状态。非洲爪蟾是发展生物学的重要模式生物，只要将DNA或mRNA注入卵母细胞或发育中的胚胎，科学家就可以在对照下研究蛋白质，故其在发展生物学上的地位举足轻重。IL-8一直是趋化因子研究领域的核心，在炎症疾病和免疫调节中具有广泛作用，还作为快速诊断细菌感染的指标。因此关于此类低等生物IL-8功能的研究有助于完善IL-8功能的研究，并为两栖类动物炎症性疾病的预防与治疗提供理论依据。由于在各种非特异性炎症性疾病发生过程中均有IL-8 参与,并且IL-8 基因易受外界刺激而被激活,IL-8 在炎症疾病和免疫调节中具有广泛作用。IL-8 也为抗炎药物研发提供了新思路。近年来，随着对细胞因子研究的不断深入和分子生物学技术的发展，大量的细胞因子得以克隆及重组表达，许多细胞因子基因工程药物面市，给治疗疾病提供了新的手段，同时创造了巨大的经济和社会效益，因此，重组XtIL-8蛋白具有潜在的巨大市场应用价值。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种从非洲爪蟾提取白细胞介素8cDNA，并提供非洲爪蟾提取白细胞介素8 cDNA的克隆方法及重组技术。

本发明从非洲爪蟾中克隆到白细胞介素8cDNA，它具有SEQ ID NO.1所示的序列。

非洲爪蟾白细胞介素8，它具有SEQ ID NO.2所示的序列。

本发明的非洲爪蟾白细胞介素8cDNA的克隆方法如下：

（1）运用电子克隆的方法克隆出非洲爪蟾白细胞介素8的CDS区设计引物：

正义寡核苷酸引物：XtIL-8F： 5’- ATGGAAACCAAGAGAAGTGTCCTG -3’ (SEQ ID NO.3)

反义寡核苷酸引物：XtIL-8R： 5’- TTAAAGAGCAGAAACAGGTGTCT -3’  (SEQ ID NO.4)

（2）从非洲爪蟾脾脏中提取总RNA，

（3）通过RT-PCR方法，以上述引物XtIL-8F及XtIL-8R为特异性引物，扩出编码区全长cDNA序列，克隆入pMD19-T载体，并对其碱基序列进行测定。

上述非洲爪蟾白细胞介素8cDNA的克隆方法具体操作如下：

（1）根据电子克隆出的非洲爪蟾白细胞介素8cDNA序列设计特异性的正义寡核苷酸引物XtIL-8F（5’- ATGGAAACCAAGAGAAGTGTCCTG -3’）与反义寡核苷酸引物XtIL-8R（5’- TTAAAGAGCAGAAACAGGTGTCT -3’）

（2）应用RNA抽提试剂TRIzol (Invitrogen 公司)，按照操作手册，提取出非洲爪蟾脾脏细胞的总RNA，