[发明专利]一种在丙酮丁醇梭菌中敲除基因的方法

权利要求书

1.一种分离的多核苷酸序列，其特征在于，所述序列含有SEQ ID NO：1所示的序列。

2.一种构建物，其特征在于，所述构建物含有权利要求1所述的多核苷酸序列。

3.如权利要求2所述的构建物，其特征在于，所述构建物以大肠杆菌-丙酮丁醇梭菌的穿梭载体作为骨架。

4.如权利要求2～3中任一项所述的构建物，其特征在于，所述构建物还含有thl启动子或ptb启动子和Cm抗性基因。

5.如权利要求2～4中任一项所述的构建物，其特征在于，所述构建物的序列如SEQ ID NO：3或26所示。

6.I-SceI归巢内切酶、权利要求1所述的多核苷酸序列或权利要求2～5中任一项所述的构建物在敲除梭菌的基因、在梭菌基因组中引入外源基因和对梭菌基因组实施突变中的应用。

7.一种在梭菌中敲除基因的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)构建一非复制型整合质粒，该质粒含梭菌的待敲除基因上下游两段同源序列和I-SceI酶切位点而不含该待敲除基因；

(2)将所述非复制型整合质粒转化所述梭菌，筛选获得整合了所述上下游两段同源序列和I-SceI酶切位点的菌株；和

(3)使用权利要求2～5中任一项所述的构建物转化步骤(2)所获得的菌株，从而将待敲除的基因从所述梭菌的基因组上敲除。

8.一种在梭菌中引入外源基因的方法，所述方法包括：

(1)构建一非复制型整合质粒，该质粒含梭菌基因中待插入位点上下游两段同源序列和I-SceI酶切位点，同时，该质粒还含有所述外源基因；

(2)将所述非复制型整合质粒转化所述梭菌，筛选获得整合了所述上下游两段同源序列、外源基因和I-SceI酶切位点的菌株；和

(3)使用权利要求2～5中任一项所述的构建物转化步骤(2)所获得的菌株，从而将所述外源基因引入所述梭菌的基因组中。

9.一种在梭菌基因组中实施突变的方法，所述方法包括：

(1)构建一非复制型整合质粒，该质粒含梭菌基因中待突变基因上下游两段同源序列和I-SceI酶切位点，同时，该质粒还含有发生了突变的该待突变基因序列；

(2)将所述非复制型整合质粒转化所述梭菌，筛选获得整合了所述上下游两段同源序列、外源基因和I-SceI酶切位点的菌株；和

(3)使用权利要求2～5中任一项所述的构建物转化步骤(2)所获得的菌株，从而将所述突变基因引入所述梭菌的基因组中。

10.如权利要求7～9中任一项所述的方法，其特征在于，所述梭菌为丙酮丁酸梭菌、拜氏梭菌、糖丁酸梭菌、糖乙酸多丁醇梭菌、丁酸梭菌、热纤梭菌、Clostridium carboxidivorans P7、Clostridium ljungdahlii、Clostridiumphytofermentans、破伤风梭菌、产气荚膜梭菌、肉毒梭菌或艰难梭菌。

11.如权利要求7～10中任一项所述的方法，其特征在于，所述梭菌为丙酮丁酸梭菌和拜氏梭菌。

12.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求2～5中任一项所述的构建物。

13.一种梭菌，其采用权利要求7～9中任一项所述的方法制备得到。

14.如权利要求13所述的梭菌，其特征在于，所述梭菌为丙酮丁酸梭菌、拜氏梭菌、糖丁酸梭菌、糖乙酸多丁醇梭菌、丁酸梭菌、热纤梭菌、Clostridiumcarboxidivorans P7、Clostridium ljungdahlii、Clostridiumphytofermentans、破伤风梭菌、产气荚膜梭菌、肉毒梭菌或艰难梭菌。

15.如权利要求13或14所述的梭菌，其特征在于，所述梭菌为丙酮丁酸梭菌或拜氏梭菌。