[发明专利]一种在丙酮丁醇梭菌中敲除基因的方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及到pSY9-1-adc和pSY14-thl两种重组质粒，可用于丙酮丁醇梭菌基因敲除。

背景技术

由于石油资源的有限性以及国际原油价格的波动性，生物丁醇目前受到越来越多的关注。丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobylicum)是一种革兰氏阳性、可产孢子、专性厌氧的细菌，它可利用多种碳源，并且在发酵过程中会产生溶剂丙酮、丁醇和乙醇，因此，丙酮丁醇梭菌也受到各国研究者的普遍重视，近年来对丙酮丁醇梭菌的代谢工程研究越来越多^1-3。

然而，该菌一直存在遗传操作系统缺乏的问题。2000年之前，研究者们都是以传统的同源重组方法在丙酮丁醇梭菌中完成基因敲除，主要分为2种，一种是将携带一段与目标基因内部同源序列的非复制型整合质粒通过单交换插入到靶基因内，使靶基因插入失活。另一种则是将含两段同源DNA序列及抗性基因的复制型整合质粒转入该菌，通过抗性的不同来选择外源DNA与靶基因发生双交换的缺失菌株。利用第一种方法，敲除的基因有buk，pta，aad，及solR基因^4-7，这种方法得到的转化子属于插入失活，但留下较多无关的外源片段，有可能影响梭菌其他基因的功能。利用第二种方法，敲除的基因有spoOA⁸，此方法的不足之处在于梭菌的同源重组效率很低，很难挑选到发生双交换的突变株，而且即使获得了双交换转化子，抗性标记仍然留在基因组上，虽然可以通过Flp-Frt系统去除标记，但仍会留下“疤痕”。自2002年到2007年，没有再出现其他关于该菌基因敲除的报道。

2007年，有研究者在该菌中发展了Targetron技术^9-12，该技术是以可移动的二类内含子来敲除靶基因，不依赖于同源重组，因而可以在梭菌中能有效地敲除基因。但是，该方法仍然属于插入失活，即使可以通过Flp-Frt系统去除抗性基因，仍然会留下内含子的序列。

总之，上述三种敲除方法都将外源的序列带入了基因组，难以完全去除。因此，本领域仍然需要一种无痕的基因敲除方法。

发明内容

基于这些问题，本发明人尝试了在丙酮丁醇梭菌中建立一种新的敲除技术，利用表达I-SceI归巢内切酶，克服该菌的同源重组效率低，而难以获得双交换转化子的问题，并且能完成无痕的基因敲除。

因此，本发明第一方面提供一种分离的多核苷酸序列，所述序列含有SEQ IDNO：1所示的序列。

在一具体实施例中，所述分离的多核苷酸序列由SEQ ID NO：1所示。

在一具体实施例中，所述分离的多核苷酸序列编码I-SceI归巢内切酶。

本发明第二方面提供一种构建物，所述构建物含有本发明的编码I-SceI归巢内切酶的多核苷酸序列。

在一具体实施例中，所述构建物以大肠杆菌-丙酮丁醇梭菌的穿梭载体作为骨架。

在一具体实施例中，所述构建物还含有thl启动子或ptb启动子。

在一具体实施例中，所述构建物还含有Cm抗性基因。

在一具体实施例中，所述构建物的序列如SEQ ID NO：3或26所示。

本发明第三方面涉及本发明分离的多核苷酸序列、I-SceI归巢内切酶或含该多核苷酸序列的构建物在敲除梭菌的基因、在梭菌基因组中引入外源基因和对梭菌基因组实施突变中的应用。

本发明第四方面提供一种在梭菌中敲除基因的方法，所述方法包括：

(1)构建一非复制型整合质粒，该质粒含梭菌的待敲除基因上下游两段同源序列和I-SceI酶切位点而不含该待敲除基因；

(2)将所述非复制型整合质粒转化所述梭菌，筛选获得整合了所述上下游两段同源序列和I-SceI酶切位点的菌株；和

(3)使用本发明的构建物转化步骤(2)所获得的菌株，从而将待敲除的基因从所述梭菌的基因组上敲除。

本发明第五方面提供一种在梭菌中引入外源基因的方法，所述方法包括：

(1)构建一非复制型整合质粒，该质粒含梭菌基因中待插入位点上下游两段同源序列和I-SceI酶切位点，同时，该质粒还含有所述外源基因；

(2)将所述非复制型整合质粒转化所述梭菌，筛选获得整合了所述上下游两段同源序列、外源基因和I-SceI酶切位点的菌株；和

(3)使用本发明的构建物转化步骤(2)所获得的菌株，从而将所述外源基因引入所述梭菌的基因组中。