[发明专利]用作非病毒基因载体材料的谷胱甘肽修饰壳聚糖共聚物及其制备和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因治疗及新材料领域，具体涉及一种以谷胱甘肽改性壳聚糖为基础的非病毒基因载体的制备方法。

背景技术

在各种人类疾病的治疗过程中，基因治疗引起了越来越多的关注。基因治疗是一种利用分子生物学方法将目的基因导入患者体内，使之表达目的基因产物，从而使疾病得到治疗的技术。载体问题一直是基因治疗研究领域的核心技术之一，基因治疗的关键技术是基因传递载体的选择。基因载体通常分为病毒载体和非病毒载体.在多数情况下，病毒载体的转染效率高，但存在毒性、免疫原性及基因转染的靶向性等问题，限制了其在临床治疗中的应用；非病毒载体虽然没有毒性问题，但是不利的生物分布以及低效的胞内运转，导致活性基因转染率低.因此提高非病毒基因载体的转染率成是当前研究的热点。

壳聚糖作为一种天然存在的、亲水性阳离子、可生物降解多糖，具有无毒、良好的生物相容性、低免疫排斥反应等一系列特殊的化学和生物特性，在非病毒基因载体方面有很大的优势。但是单一的聚阳离子片段在生物体内易发生聚集被原生质体清除，改进方法是在壳聚糖上接枝分散性和生物相容性都很好的聚乙二醇片段，不仅增加了其水溶性，更重要的是增加其分散性和循环时间。谷胱甘肽是一种广泛存在于生物体内的功能性三肽，将其引入壳聚糖体系，可以利用谷胱甘肽上的巯基与细胞膜作用，增强聚合物的细胞膜透过性，同时，巯基在共聚物中与DNA形成复合物中可发生交联作用而有利于其在转运过程中的稳定以及进入细胞内后DNA的释放，达到提高转染效率的目的。

发明内容

本发明旨在提供一种制备谷胱甘肽改性壳聚糖共聚物，具有低毒性、高转染效率的非病毒基因载体的方法。

本发明用作非病毒基因载体材料的谷胱甘肽修饰壳聚糖共聚物，主要由烯丙基化壳聚糖、亲水性的刷状聚乙二醇大分子链以及谷胱甘肽组成，其结构示意如图1所示。

所述的壳聚糖分子量为3-100千道尔顿，脱乙酰度不低于90％。

所述的亲水性的刷状聚乙二醇大分子链是由聚乙二醇分子量为200-10000的(甲基)丙烯酸酯单体(MPEG)通过可控自由基聚合成分子量为3-100千道尔顿含有端羧基的刷状亲水活性大分子链。

所述的刷状亲水活性大分子链是以4，4’-偶氮4-氰基戊酸(ACVA)为引发剂以及4-氰基戊酸-二硫代苯酯为链转移剂(CPADB)制得。

所述的谷胱甘肽是指还原态的谷胱甘肽。

所述的用作非病毒基因载体材料的谷胱甘肽修饰壳聚糖共聚物的方法，包括如下步骤：

1)壳聚糖经烯丙基化得烯丙基化壳聚糖衍生物。

2)以RAFT可控自由基聚合制得活性亲水性聚合物PMPEG。

3)利用自由基偶联法制备PMPEG接枝壳聚糖共聚物，CS-PMPEG。

4)谷胱甘肽经用EDC和NHS活化法连接到PMPEG接枝壳聚糖共聚物的PMPEG链端，得谷胱甘肽接枝共聚物，CS-PMPEG-GSH。

所述的用作非病毒基因载体材料的谷胱甘肽修饰壳聚糖共聚物的应用方法，用作非病毒基因载体材料。

用作非病毒基因载体材料所进行的共聚物(CS-PMPEG-GSH)的细胞转染方法，其步骤为：

1)CS-PMPEG-GSH/DNA复合物的制备：将聚合物溶于乙酸钠溶液中，配制成CS-PMPEG-GSH溶液，然后将配置好的经绿色荧光蛋白标记的DNA溶液，等体积加入到聚合物溶液，混合后，室温静置30分钟，然后静置得到CS-PMPEG-GSH/DNA复合物溶液；

2)体外细胞转染实验：

将NIH3T3细胞在培养板上培育，然后加入谷胱甘肽接枝壳聚糖共聚物CS-PMPEG-GSH/DNA复合物，培育完成后，用流式细胞仪定量测定转染效率。

所述的DNA是质粒DNA。

本发明的制备谷胱甘肽改性壳聚糖共聚物非病毒基因载体的方法，其步骤如下：

1)烯丙基壳聚糖的制备。

2)亲水性刷状聚乙二醇活性聚合物(PMPEG)的制备。

3)刷状聚乙二醇聚合物接枝壳聚糖的制备。

4)谷胱甘肽接枝壳聚糖共聚物(CS-PMPEG-GSH)的制备。

本发明谷胱甘肽接枝壳聚糖共聚物(CS-PMPEG-GSH)的细胞转染方法步骤为：

1)CS-PMPEG-GSH/pDNA复合物的制备。

2)NIH3T3细胞转染。

本发明的主要优点：