[发明专利]重组荧光双杂交酵母及其检测方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域中重组荧光双杂交酵母及其检测方法与应用。

背景技术

酵母双杂交技术(yeast two hybrid)是利用酵母遗传学方法分析蛋白质间的相互作用的实验系统，常用于验证已知蛋白质间的相互作用或筛选与靶蛋白特异作用的候选蛋白。酵母双杂交技术已广泛应用于细胞周期调控、信号转导、肿瘤基因表达、药代动力学等多个研究领域。

Fields和Song首先在研究真核基因转录调控中建立了酵母双杂交系统，该系统基于对酵母转录因子GAL4的完整认识，它具有两个功能相对独立的域：DNA结合域(DNA binding domain，BD)和转录激活域(activation domain，AD)，BD能够识别GAL4效应基因(GAL4-responsive gene)的上游激活序列(upstream activatingsequence，UAS)，并与之结合。而AD则通过与转录机器(transcription machinery)中的其他成分之间的作用，启动UAS下游的基因进行转录。BD和AD单独作用均不能激活转录反应。而当两者在空间上接近后，不需要形成共价键即可激活转录。这便构成双杂交体系的基础。

在经典的酵母双杂交系统中，将待研究的两种蛋白质的基因分别克隆到酵母表达载体的GAL4-AD和GAL4-BD的下游，进行融合表达，分析蛋白互作。具体来说，X和Y为两个未知相互作用的蛋白，将DB-X的融合蛋白称作诱饵(bait)，X通常是已知蛋白，AD-Y称作猎物(prey)，如果bait与prey能够在宿主细胞核内同时表达，则BD和AD形成转录激活复合物，从而激活报告基因的表达。该基因的表达可以通过生化或遗传学的方法检测得到，即可实现对于蛋白质(X和Y)间相互作用的研究。作为研究分析蛋白质与蛋白质之间相互作用的体系，酵母双杂交的最大的优势在于不需要分离纯化蛋白质。同时，由于酵母生长速度快、易于操作，该系统兼具了简便有效的特点。

目前酵母双杂交体系常用的报告基因有LacZ和营养缺陷型标记如His等，前者可以通过ONPG(或其他底物)存在时的颜色反应筛选阳性克隆，后者则根据筛选培养基上的生长与否判断。但作为一种检测方法，营养缺陷标记作为报告基因无法对蛋白互作进行相对定量。而LacZ的检测通常需要破碎细胞，温浴显色等步骤，操作繁琐、耗时耗力。这些缺点已成为双杂交酵母高通量、快速检测蛋白互作的障碍。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种融合基因。

本发明所提供的融合基因，由序列表中序列5第9到1030位核苷酸所示的DNA片段、报告基因、终止子、筛选标记蛋白表达盒和序列表中序列5第4336到5226位核苷酸所示的DNA片段依次连接构成的融合基因。

所述终止子的核苷酸序列为序列表中序列5第2803到3130位所示；

所述报告基因为荧光素酶报告基因；

所述筛选标记蛋白表达盒为HIS Box表达盒。

所述荧光素酶报告基因的核苷酸序列如序列表中序列5第1063到2715位所示；

所述HIS Box表达盒的核苷酸序列为序列表中序列5第3152到4329位所示。

所述融合基因为序列表中序列5第9到5226位所示的DNA分子。

含有所述融合基因的重组质粒也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种重组酵母菌。

本发明所提供的重组酵母菌，是将所述融合基因导入宿主酵母菌得到的；所述宿主酵母菌为缺失GAL4基因和GAL80基因的酵母菌。

所述宿主酵母菌为酵母菌Y187。

本发明的又一个目的是提供检测所述重组酵母菌中荧光素酶活性的方法。

本发明所提供的检测所述重组酵母菌中荧光素酶活性的方法，包括以下步骤：

(1)使权利要求6或7所述的重组酵母菌中荧光素酶表达，得到荧光素酶表达的重组酵母菌；

(2)将步骤(1)得到的所述重组酵母菌进行震荡培养，至菌液的OD₆₀₀值为0.4-1.5或0.4或1.0或1.5，得到的菌液为待测菌液；培养容器内的所有物质记作菌液；

(3)将荧光素酶底物溶解于柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中得到荧光素酶底物溶液，将得到的荧光素酶底物溶液与所述待测菌液混合，得到混合物，检测混合物的荧光值，即得到所述荧光素酶活性。

所述震荡培养是在温度为30℃和转速为200rpm的条件下进行，旋转半径为1.3cm；所述震荡培养的培养基为营养缺陷型SD培养基。