[发明专利]一种通过温度突变提高哺乳动物细胞重组蛋白瞬时表达的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说是提供一种新的提高重组蛋白在哺乳动物细胞中的瞬时转染表达的方法。

背景技术

利用哺乳动物细胞生产重组蛋白的系统已经建立了较长时间。相对与低等真核细胞表达系统或者原核细胞表达系统，哺乳动物细胞系统生产的重组蛋白因为其具有能最佳的表达高分子量的蛋白质产物、使复杂结构的蛋白产生正确的折叠和给糖蛋白提供合适的翻译后修饰的功能而成为生物制药领域的表达重组蛋白的最佳选择【Chen P，Hutter D，Liu P，et al.Protein Expr Purif，2002；24(3)；481-488】。

传统的哺乳动物细胞表达系统是构建细胞稳定表达的将外源基因整合到宿主细胞染色体上的稳定株表达系统。构建稳定株表达系统生产重组蛋白需要在DNA导入细胞后进行长时间的筛选，然后才能确定表达量高并且稳定的细胞株，这个过程通常需要几个月的时间并且花费大量的人力来完成。

随着生命科学和生物制药的飞速发展，大量的蛋白被用于基础研究和药物开发，急需一个能在短时间内就能得到重组蛋白的方法。基因瞬时表达应运而生，与稳定株表达系统不同，瞬时转染的外源DNA不整合到宿主细胞DNA中，其在细胞中的数目通常随着细胞的分裂而减少，因此蛋白表达只能维持几天到十几天的时间，但其优点是能在短短几天之内拿到基因的表达产物，而且其通用性强【Cullen，B.R.(1987).Methods Enzymol.，152，684-704.Blasey，H.D.，Aubry，J.-P.，Mazzei，G.and Bernard，A.(1996).Cytotechnology，18，183-192.Cachianes，G.，Ho，C.，Weber，R.F.，Williams，S.R.，Goeddel，D.V.and Leung，D.W.(1993).Biotechniques，15，255-259.】。随着磷酸钙和PEI等价格低廉的转染试剂的使用，这项技术获得了很大的发展【Boussif，O.，Lezoualc’h，F.，Zanta，M.A.，Mergny，M.D.，Scherman，D.，Demeneix，B.and Behr，J.P.(1995)Proc.Natl Acad.Sci.USA，92，7297-7301】。但是相对于构建稳定株表达的系统来说，瞬时转染生产重组蛋白存在转染效率低、表达量低的缺点，使得此方法的应用受到较大的限制。因此怎样提高瞬时转染的效率、提高表达量成为亟待解决的问题。

之前已经有些提高瞬时转染蛋白表达的研究报道：比如优化构建适合瞬时转染的细胞和载体；选择合适细胞的转染试剂；优化转染试剂和DNA的比例；优化转染时的细胞密度；添加一些生长因子、程序性细胞死亡抑制剂或者与一些生长因子共转染表达；通过控制培养基的pH；转染后的细胞加入不同的蛋白水解物；在转染和表达过程中将细胞暴露于丁酸钠溶液来增加受感染细胞的百分数、诱导蛋白质的合成；使用2-氨基嘌呤来提高重组蛋白的表达量【DUROCHER，Y，et al.，Anal Biochem，2000.284(2)：p.316-26.BALDI，L，et al.，Biotechnol Prog，2005.21(1)：p.148-53.MEISSNER，P，et al.，Biotechnol Bioeng，2001.75(2)：p.197-203.STETTLER，M，et al.，Biotechnol Bioeng，2006.FUSSENEGGER，M，et al.，Nat Biotechnol，1998.16(5)：p.468-72】。通过上面的方法来提高细胞的转染效率和转染后细胞的高密度生长和蛋白表达。美国专利US2008/0145893将这些因素组合起来使用，达到了一个较高的表达量和转染效率，但其工艺复杂，所用试剂昂贵，不适合大规模推广使用。