[发明专利]一种可用于外源基因表达的载体及细胞株筛选方法

权利要求书

1.一种获得目的蛋白稳定表达的真核细胞表达载体，该载体包含：

a)一个包含强病毒启动子的目的蛋白表达盒，该表达盒放置于筛选标记的基因内部；

b)一个包含弱病毒启动子的筛选标记表达盒，该筛选标记基因序列中加入了内含子元件，目的蛋白的表达盒被放置于该内含子元件中；

c)一个包含弱真核细胞启动子的扩增标记的表达盒。

2.权利要求1所述的表达目的蛋白的表达盒中的强病毒启动子包含人CMV启动子部分加上人CMV内含子部分，该强病毒启动子的序列为SEQ IDNO：12。

3.权利要求1所述的强病毒启动子表达盒使IFNγR1受体Fc融合蛋白在未扩增CHO细胞株的平均表达水平达到1～3皮克/细胞/天。

4.权利要求1所述的内含子元件位于筛选标记基因的内部，该载体仍表达出有活性功能的筛选标记，该内含子元件的序列为SEQ ID NO：7。

5.权利要求1所述的筛选标记的表达盒使在相同筛选剂浓度下耐受生长的细胞克隆数量明显减少，表达目的基因的细胞克隆的比例及表达量都明显偏高。

6.权利要求1所述的筛选标记为潮霉素B磷酸转移酶，新霉素磷酸转移酶，黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶或谷氨酰胺合成酶。

7.权利要求1所述的扩增标记表达盒使在较低扩增剂浓度的压力下基因扩增，抗体的表达量得到迅速增加。

8.权利要求1所述的弱真核细胞启动子为弱化的人泛醌蛋白启动子(hUbc)，该启动子的序列为SEQ ID NO：3。

9.权利要求1所述的扩增标记为二氢叶酸还原酶(DHFR)，扩增剂为氨甲喋呤(MTX)。

10.一种目的蛋白稳定表达细胞株的筛选方法，该筛选方法包括：

a)用筛选标记的抗生素筛选获得的目的蛋白稳定表达的细胞株；

b)用扩增标记的基因扩增筛选获得的目的蛋白表达水平明显提高的细胞株。

11.权利要求10所述的蛋白稳定表达细胞株为dhfr基因缺陷型的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞株。

12.权利要求10所述的筛选标记为潮霉素B磷酸转移酶时，所使用的筛选剂Hyg的使用浓度为0.4～2.0mg/ml。

13.权利要求10所述的扩增标记物为二氢叶酸还原酶时，所使用的扩增剂MTX的使用浓度为30nM～300nM。

14.一种目的蛋白表达方法，该方法包含用权利要求1所述的真核细胞表达载体和权利要求10所述的筛选方法获得的稳定表达CHO细胞株。

15.权利要求14中所述的蛋白是受体蛋白，细胞因子，抗体，激酶或其他功能蛋白。

16.权利要求14所述的蛋白表达方法使IFNγR1受体Fc融合蛋白的表达水平大于100mg/L，单位细胞表达水平(Qp)达到50～60皮克/细胞/天。

17.权利要求16所述的蛋白表达水平是细胞在含血清贴壁条件下培养获得的。